燧心胶囊对心肌梗死后心衰大鼠心功能及心肌肌浆网钙泵基因表达的影响∗

郭丹丹 于思明 张鸿婷 赵海燕

（1.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001；2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040）

流行病学研究表明，在55岁以上的中国人中，近1.3%的人出现了各种心衰症状［1］。大多数心衰患者表现为心肌功能减退和血流不足，导致患者运动能力下降［2］。在东方国家（如中国、韩国和日本），许多人更喜欢使用草药治疗心血管疾病［3］。燧心胶囊是一种中药复方制剂，可以提高左室射血分数，改善心力衰竭患者的临床症状［4］。然而，这种心脏保护作用的确切分子机制尚不清楚。细胞内钙离子（Ca2+）释放通道和内质网钙储存分子结构的阐明有助于我们深入了解健康和受损心脏的Ca2+稳态和钙释放-收缩耦合相关机制［5］。有报道称，肌浆网Ca2+的异常释放可能导致心衰患者的收缩功能障碍和心律失常［6］。心衰患者内质网中钙含量的降低可能是由于肌浆网钙泵（肌浆网Ca2+-ATP酶，SERCA）对肌浆网摄取和储存Ca2+的抑制减少，导致心肌细胞除极化时细胞质内Ca2+浓度降低，使心肌舒缩功能减弱［7］。基于此，本研究探讨心肌梗死后心衰大鼠心功能的影响，检测SERCA基因表达水平，以期从分子水平阐明燧心胶囊改善心功能的可能药理作用机制，为燧心胶囊的临床运用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠90只，体质量200～240 g，6周龄，购于哈尔滨医科大学实验动物中心，许可证：SCXK（黑）2018-0018。对动物的处置符合《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.2 试药与仪器 1）试药。燧心胶囊（由制附子、红参、丹参、茯苓、白术、泽泻组成，黑龙江中医药大学附属二院制剂室制备，去掉胶囊皮，用蒸馏水溶解后制成生药含量0.27、0.54、1.08 g/mL的备用液）；卡托普利（江苏黄河药业股份有限公司，用蒸馏水溶解后制成、1.0 mg/mL的备用液）；水合氯醛（上海上药新亚药业有限公司）；TRIzol（天根生化科技有限公司）；RNA反转录试剂盒（大连TaKaRa公司）；荧光定量PCR试剂盒（大连 TaKaRa公司）；SERCA、受磷蛋白（PLB）和GADPH引物由大连TaKaRa公司设计并合成：SERCA上游引物为 5′-TCTGACTTTCGTTGGCTGTG-3′，下游引物为5′-GCCTTTGTTATCCCCAGTG-3′；PLB上游引物为 5′-CTTTTGTCTTCCTGGCATCA-3′，下游引物为5′-AGGTTCTGGAGGTTCTGACG-3′；GAPDH 引物序列：上游引物为5′-TCCCATCACCATCTTCCAG-3′，下游引物为：5′-GGTATCCATCGCCATGCTC-3′。2）仪器。VM7型便携式彩色多普勒超声诊断仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）；BL-410生物检测系统（成都泰盟公司）；NanoDrop2000c型蛋白核酸检测仪（美国Thermo公司）；实时荧光定量PCR仪（美国BD公司）。

1.3 分组与造模 随机选择80只大鼠进行心肌梗死后心衰模型制备，剩余大鼠作为假手术组。大鼠术前12 h禁食，用10%水合氯醛（0.30 mL/100 g）麻醉后进行气管插管，连接呼吸机予以正压通气，在左侧第4肋开胸，分离心包膜，暴露心脏，采用左前降支冠状动脉结扎产生心肌梗死，结扎后心室颜色变暗，同时心电图显示ST段抬高，则认为该急性心肌梗死模型是成功的，术后关腹缝合。假手术组接受同样的手术，但不进行冠状动脉结扎。4周后以多普勒超声显示左心室射血分数（LVEF）≤45%为心衰模型成功标志［8］。有43大鼠造模成功，将造模成功大鼠分为模型对照组（8只）、卡托普利组（8只）；燧心胶囊低剂量组（9只）、燧心胶囊中剂量组（9只）和燧心胶囊高剂量组（9只）。燧心胶囊低、中、高剂量组依次灌胃给予2.7、5.4、10.8 g/kg的燧心胶囊，卡托普利组给予5.83 mg/kg卡托普利，每日1次，连续8周。假手术组和模型对照组给予等量0.9%氯化钠注射液。

1.4 标本采集与检测 1）心功能检测。末次给药1 h后，对大鼠进行麻醉，采用VM7型便携式彩色多普勒超声诊断仪分别测量左室收缩末期内径（LVESD）、左室舒张末期内径（LVEDD）、左室射血分数（LVEF）、左心室短轴缩短率（LVFS），取3个心动周期求平均值。2）血流动力学检测。做完心功能检测后，分离右颈外动脉，穿刺插入PE50小鞘管，与BL-410生物检测系统连接，将鞘管送入左心室，记录左室收缩压（LVSP）、左室舒张末期压（LVEDP）、左心室内压最大上升速率（+dp/dtmax）、左心室内压最大下降速率（-dp/dtmax）。3）RT-PCR法检测SERCA和PLB mRNA表达。心功能血流动力学检测结合后处死大鼠，取约0.1 g左心室组织，用液氮充分研磨后加入1 mL TRIzol进行总RNA提取，然后合成cDNA，制备20 μL反应体系进行扩增。以GADPH作为内参，采用2-ΔΔCt法计算SERCA和PLB mRNA的相对表达量。

1.5 统计学处理 应用IBMSPSS19.0统计软件。实验结果以（±s）表示，采用单因素方差分析进行判断，组间两两比较用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠心功能指标比较 见表1。与假手术组比较，模型组大鼠LVESD、LVEDD、LVEF、LVFS差异具有统计学意义（P＜0.05），表明模型组大鼠泵血功能下降，造模成功。与模型组比较，卡托普利组和各燧心胶囊治疗组大鼠LVESD和LVEDD降低，LVEF和LVFS增高，各燧心胶囊治疗组大鼠LVESD、LVEDD、LVEF、LVFS随药物剂量增加而变化，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 各组大鼠血流动力学参数比较 见表2。与假手术组比较，模型组大鼠LVSP和LVEDP升高，+dp/dtmax和-dp/dtmax降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，卡托普利组和各燧心胶囊治疗组大鼠LVSP和LVEDP降低，+dp/dtmax和-dp/dtmax升高，各燧心胶囊治疗组大鼠LVSP、LVEDP、+dp/dtmax和-dp/dtmax随药物剂量增加而变化，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表1 各组大鼠心功能指标比较（±s）

表1 各组大鼠心功能指标比较（±s）

与假手术组比较，#P＜0.05；与模型组比较，∗P＜0.05；与卡托普利组比较，&P＜0.05。下同

组别假手术组模型组卡托普利组燧心胶囊低剂量组燧心胶囊中剂量组燧心胶囊高剂量组n 108 8 9 9 9 LVESD（mm）3.94±0.426.51±0.43#4.62±0.39#*5.97±0.24#*&5.64±0.47#*&4.77±0.35#*LVEDD（mm）5.68±0.368.39±0.54#6.21±0.57#*7.64±0.40#*&7.25±0.81#*&6.43±0.58#*LVEF（%）78.06±8.6240.28±5.43#66.49±7.18#*47.81±9.22#&53.48±7.03#*&59.01±4.52#*LVFS（%）40.95±5.6320.35±4.01#34.45±6.79#*20.17±3.53#&29.12±4.00#*&31.08±5.01#*&

表2 各组大鼠血流动力学参数比较（±s）

表2 各组大鼠血流动力学参数比较（±s）

组别假手术组模型组卡托普利组燧心胶囊低剂量组燧心胶囊中剂量组燧心胶囊高剂量组n 108 8 9 9 9 LVSP（mmHg）125.37±18.12192.10±20.49#142.25±17.01#*171.04±21.55#&135.36±18.11#*&109.32±21.08#*LVEDP（mmHg）7.68±0.5218.20±1.94#11.21±2.13#*15.02±1.07#&13.23±1.81#&10.43±2.14#*+dp/dtmax（mmHg/s）5453.06±416.142054.18±227.34#3249.84±315.76#*2122.58±207.65#&2448.38±184.57#&3204.05±286.52#*-dp/dtmax（mmHg/s）5545.97±199.341886.64±148.28#3482.15±346.05#*2024.61±159.56#&2584.26±248.36#*&3161.22±260.28#*&

2.3 各组大鼠心肌组织中SERCA和PLB mRNA表达水平的比较 见表3。与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织中SERCA mRNA表达降低，PLB mRNA表达升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，卡托普利组和各燧心胶囊治疗组大鼠心肌组织中SERCA mRNA表达升高，PLB mRNA表达降低，各燧心胶囊治疗组大鼠心肌组织中SERCA和PLB mRNA表达水平随药物剂量增加而变化，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表3 各组大鼠心肌组织中SERCA和PLB mRNA表达水平比较（±s）

表3 各组大鼠心肌组织中SERCA和PLB mRNA表达水平比较（±s）

组别假手术组模型组卡托普利组燧心胶囊低剂量组燧心胶囊中剂量组燧心胶囊高剂量组n 1088999 SERCA mRNA 1.00±0.050.51±0.03#0.84±0.04#*0.64±0.07#*&0.71±0.03#*&0.77±0.08#*PLB mRNA 1.00±0.033.81±0.25#1.54±0.19#*2.85±0.27#*&2.41±0.16#*&1.94±0.22#*&

3 讨论

在本研究中，我们利用左前降支冠状动脉结扎法制备大鼠心衰模型证明，燧心胶囊治疗可以改善心衰大鼠的心功能，降低LVESD、LVEDD、LVSP和LVEDP，增高LVEF、LVFS、+dp/dtmax和-dp/dtmax。这些效应与血管紧张素转换酶抑制剂卡托普利所产生的效应类似，提示燧心胶囊可以用于心衰的治疗［9］。同时本研究发现，心衰大鼠心肌细胞中SERCA mRNA表达降低，而SERCA对维持心脏收缩和舒张功能具有重要意义［10］。因此，本研究从分子水平探讨燧心胶囊治疗心衰的作用机制。

心肌收缩力降低是心衰的一个显著特征，而心肌收缩力不足的大部分原因是心肌细胞Ca2+瞬变。肌浆网在调节细胞内Ca2+浓度中起关键作用［11］。SERCA将Ca2+从细胞质转运到肌浆网中，从而决定了兴奋-收缩耦合所需的Ca2+浓度［12］。本研究观察到心衰大鼠LVESD和LVEDD显著升高，伴有SERCA活性降低。钠钙交换器的上调和SERCA活性的降低可能是心衰中内质网中Ca2+含量降低的原因［13］。因此，SERCA活性降低可能是心衰大鼠左室功能障碍的部分原因。我们的研究表明，燧心胶囊增加SERCA的活性，改善细胞内Ca2+循环。

PLB是一种SERCA抑制蛋白，是SERCA的主要调节剂，主要存在于心室，在心房中存在较少［14］。研究发现，在慢性心衰患者中，SERCA和PLB的含量有显著的变化［15］。在非磷酸化状态下，PLB能抑制SERCA对Ca2+的摄取。当PLB发生磷酸化时，可以减轻对SERCA的抑制作用，从而增加Ca2+进入内质网［16］。因此，PLB在心脏的兴奋-收缩耦合中起着生理制动的作用，从而调节心脏的功能。PLB的表达水平决定了心脏舒张和收缩，PLB的活性减低与SERCA对Ca2+亲和力的增加有关，SERCA对Ca2+亲和力的增加促进了内质网对Ca2+的摄取和抑制Ca2+释放［17］。目前的研究结果表明，通过燧心胶囊治疗，心衰大鼠PLB mRNA水平降低，SERCA mRNA水平升高，表明燧心胶囊有助于心脏保护作用。但本研究没有对PLB和SERCA蛋白水平的检测，我们将在后续的研究中进行完善。

本研究以卡托普利作为阳性对照，其能通过抑制血管紧张素转换酶（ACE）显著改善心脏功能和增加SERCA活性［18］。ACE可以抑制神经内分泌系统的过度活化，减轻心脏负荷，预防和逆转心室重构，改善心肌功能，保护心肌细胞。抑制ACE的药物还可以增加SERCA活性和内质网钙转运［19］。这些效应不仅通过抑制内质网Ca2+的释放作用，还有利于心肌松弛，增强心肌收缩力。本研究提示，燧心胶囊对心衰大鼠的心功能增加和调节SERCA的作用与卡托普利相当。

综上所述，燧心胶囊可以增强心衰大鼠射血能力，改善心功能，可能与燧心胶囊使心衰大鼠心肌细胞中SERCA基因的表达增加有关，为燧心胶囊治疗心衰提供了理论依据。