加味芎蝎散对咳嗽变异性哮喘大鼠气道黏膜上皮连接相关蛋白表达的影响∗

2019-10-09 02:41林美娇徐荣谦方顺顺杨冬妹孙洮玉
中国中医急症 2019年9期
关键词:特钠孟鲁司空白对照

杨 斌 李 燕 林美娇 徐荣谦 方顺顺 杨冬妹 孙洮玉△

(1.中国中医科学院西苑医院,北京 100091;2.北京中医药大学东直门医院,北京 100700)

咳嗽变异性哮喘(CVA)是以咳嗽为唯一症状的特 殊类型哮喘。调查显示,CVA发病率约占儿童慢性咳嗽的41.95%[1],为儿童咳嗽的常见病因。据报道30%的CVA患儿会转变为典型哮喘[2]。CVA发病机制复杂,研究表明可能与遗传、解剖、免疫、炎症等多种因素有关[3]。近年来发现,上皮屏障功能的减退是引起CVA发生的高危因素[4-5],因此,增强上皮细胞表面连接是防治CVA有效措施。加味芎蝎散是本文作者徐荣谦教授的经验方,临床应用效果显著,能够降低气道炎症,改善通气,降低复发发生率[6-7]。本研究拟通过观察加味芎蝎散对CVA大鼠肺泡灌洗液炎细胞及肺组织形态学的影响,观察细胞连接相关蛋白在大鼠支气管黏膜上皮的表达情况,研究中药对CVA的防治机理,并探索加味芎蝎散对支气管黏膜组织的可能作用靶点。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 40只SPF级SD大鼠,雌雄各半,体质量220~250 g,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,动物生产许可证号:SCXK(京)2012-0001。动物适应性饲养3 d,自由进食标准大鼠饲料,自由饮水和摄食,自然光照,室温(22±2)℃,湿度(40±10)%。

1.2 试药与仪器 1)药物:中药加味芎蝎散,组成:川芎5 g,全蝎3 g,芦根20 g,荜茇1 g,半夏5 g,细辛1 g,五味子10 g,白前10 g(北京康仁堂药业有限公司提供),用中药煎药机煎制,制成煎剂,含生药量3 g/mL。按大鼠体表面积换算,大鼠给药剂量为0.5 g/(kg·d)。孟鲁司特钠片(杭州默沙东公司生产,规格4 mg/片,批号H37021289),取药片溶于蒸馏水中,配制质量浓度2 g/mL。卵蛋白OVA(美国Sigma公司,批号A5253-1009),Al(OH)3凝胶(美国Sigma公司,批号A8222-250)。2)试剂:白介素-33(IL-33)、胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)试剂盒(美国 R&D Systems公司),E-cadherin抗体(英国abcam公司,货号ab76055),紧密连接蛋白(ZO-1)(英国abcam 公司,货号ab221547),Claudin3抗体(英国abcam公司,货号ab15102),PV6000免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物科技有限公司),HRP标记二抗、ECL发光液显色(北京普利莱科技有限公司)。3)仪器:Olympus BX53型显微镜(日本Olympus公司);Image-Pro Plus 6.0软件(美国Media Cybernetics公司);DYY-6C型电泳仪(北京市六一仪器厂),凝胶成像分析系统(美国Bio-Rad公司)。

1.3 分组及造模 将40只SD大鼠按照随机数字表法分为空白对照组10只与造模组30只。大鼠适应性饲养1周后,根据文献报道[8]及研究者既往造模经验建立CVA模型。具体方法如下:造模组首日肌注2%OVA 1 mL,腹腔注射20%Al(OH)31 mL,从第3周起,超声波雾化器内1%OVA溶液攻击。每日1次,持续1周。当大鼠出现呼吸急促、腹肌收缩、咳嗽等形态学改变,确定造模成功;外周血中嗜酸性粒细胞百分比显著高于空白对照组亦证明造模成功。30只造模组大鼠随机分为模型组、孟鲁司特钠组以及中药组,每组10只。

1.4 给药方法 空白对照组与模型组以蒸馏水10 mL/(kg·d)灌胃,孟鲁司特钠组灌胃药液10 mg/(kg·d),中药组灌胃中药液50 g/(kg·d),每日1次,共4周。各组大鼠均于末次给药后收集腹主动脉血,颈部脱臼法处死,快速取出肺组织,左肺放入中性甲醛液中固定48 h待包埋,右肺下叶组织,约400 mg放入-70℃超低温冰箱冻存。

1.5 标本采集与检测 1)ELISA法检测肺组织中TSLP、IL-33的含量:取20 mg左右冻存肺组织,加人200 μL生理盐水低温匀浆1 min,2次离心后,取上清得匀浆液,BCA试剂盒检测浓度,配制标准曲线,加样孵育、洗涤,酶标抗体TSLP、IL-33孵育、洗涤,加HRP底物液显色,终止反应后,450 nm处检测吸光度。2)各组大鼠肺组织病理学观察:中性甲醛液固定左肺上叶组织48 h,脱水、石蜡包埋,4 μm切片,常规苏木素-伊红(HE)染色后,光镜下观察肺组织形态学变化。3)免疫组化法测定E-caderin、ZO-1、Claudin3的蛋白表达:左肺上叶组织石蜡包埋,4 μm切片,烘箱70℃烤片1 h,二甲苯、梯度乙醇脱蜡,3%的过氧化氢避光10 min以灭活内源性酶;枸橼酸盐修复液(pH6.0)高压热修复3 min;滴加ZO-1、E-caderin、Claudin3抗体(浓度分别为1∶100,1∶400,1∶200),4 ℃冰箱孵育过夜滴加辣根过氧化物酶标记的IgG抗体(二抗),常温孵育30 min,DAB显色,镜下控制反应时间,显色后自来水洗,苏木素复染,透明,封片。光镜下观察,阳性为支气管黏膜上皮胞膜棕黄色颗粒,胞浆亦有少量表达,阴性对照用PBS代替一抗,每张切片随机取5个高倍视野(400倍),Image-Pro Plus 6.0测定阳性信号的积分光密度(IOD)值。4)Western blotting测定E-caderin、ZO-1、Claudin3的蛋白表达。冰上裂解右肺下叶组织约50 μg,匀浆器匀浆,BCA法测定各样本的蛋白浓度,根据浓度计算并调整样本为统一蛋白浓度。SDS-PAGE凝胶电泳,浓缩胶和分离胶均为10%,湿法转PVDF膜,转膜后室温封闭,之后孵育相应ZO-1、E-caderin、Claudin3一抗,浓度均为1∶1000,4℃孵育过夜,次日PBS-T清洗后,孵育HRP标记的第二抗体1 h,ECL发光液显色,凝胶成像系统化学发光成像,保存数据为图片,应用Quantity One对条带进行分析,用GAPDH为内参,以比值结果作为目标蛋白的相对表达量。

1.6 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件。计量资料以(±s)表示,组间比较采用单因素方差分析;计数资料组间比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肺组织中细胞因子表达水平 见表1。模型组大鼠肺组织中细胞因子IL-33、TSLP的含量均高于空白对照组,而中药组和孟鲁司特钠组可以明显抑制肺组织中IL-33、TSLP的上升。中药组与孟鲁司特钠组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 各组大鼠肺组织中细胞因子表达水平比较(ng/mL,±s)

表1 各组大鼠肺组织中细胞因子表达水平比较(ng/mL,±s)

与模型组比较,∗P<0.05,∗∗P<0.01;与空白对照组比较,△P<0.05,△△P<0.01。下同

组别空白对照组模型组孟鲁司特钠组中药组n IL-3328.75±4.5447.63±6.80△△39.25±5.54*36.87±4.83**TSLP 115.52±17.80170.64±21.32△△148.66±23.53*143.33±20.49*

2.2 各组大鼠肺组织病理改变 见图1。空白对照组支气管、肺泡腔、间质及血管均未见明显炎症浸润,支气管管腔内未见分泌物,黏膜皱襞及黏膜上皮形态未见异常。模型组肺组织内多量炎细胞浸润,黏膜上皮层纤毛柱状上皮细胞变性、脱落,黏膜皱襞变平,管腔内可见黏液栓。孟鲁司特钠组以及中药组可有模型组的表现,但较模型组均有明显的减轻表现。

图1 各组肺组织病理学改变(HE染色,100倍)

2.3 各组大鼠支气管黏膜上皮E-caderin、ZO-1、Claudin3的免疫组化比较 见表2,图2~4。E-caderin、ZO-1、Claudin3在气道黏膜上皮、部分气道平滑肌、血管平滑肌及个别肺间质中呈胞膜及胞浆上棕黄色表达,本次实验仅观察并统计气道黏膜上皮组织染色。空白对照组中E-caderin、ZO-1、Claudin3表达较高,呈强阳性表达,而在模型组中呈弱阳性表达,表达量明显减低(P<0.01)。与模型组比较,孟鲁司特钠组和中药组表达明显增强(P<0.05),但均弱于空白对照组。中药组与孟鲁司特钠组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 各组大鼠气道黏膜上皮E-caderin、ZO-1、Claudin3的蛋白表达比较(IOD,±s)

表2 各组大鼠气道黏膜上皮E-caderin、ZO-1、Claudin3的蛋白表达比较(IOD,±s)

组别空白对照组模型组孟鲁司特钠组中药组n E-caderin 25.35±2.7710.45±3.23△△18.35±3.09*17.59±2.46**ZO-122.65±6.859.21±2.48△△17.35±2.56*19.08±2.82*Claudin323.45±2.6912.69±2.86△△18.92±3.09*18.29±2.37*

图2 各组E-cadherin免疫组化(100倍)

图3 各组ZO-1免疫组化(200倍)

图4 各组Claudin3免疫组化(200倍)

2.4 各组大鼠支气管黏膜上皮E-caderin、ZO-1、Cla-udin3蛋白表达比较 见表3,图5。空白对照组中E-caderin、ZO-1、Claudin3表达强度高,而在模型组中表达量明显减低(P<0.05或P<0.01)。与模型组比较,孟鲁司特钠组和中药组表达量均有不同程度的增高(P<0.05)。中药组与孟鲁司特钠组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 各组大鼠气道黏膜上皮E-caderin、ZO-1、Claudin3的蛋白表达比较(目标蛋白/内参GAPDH,±s)

表3 各组大鼠气道黏膜上皮E-caderin、ZO-1、Claudin3的蛋白表达比较(目标蛋白/内参GAPDH,±s)

组别空白对照组模型组孟鲁司特钠组中药组n E-caderin 0.81±0.070.68±0.08△0.75±0.09*0.74±0.06*ZO-10.80±0.060.62±0.08△△0.73±0.09*0.72±0.11*Claudin30.85±0.070.59±0.06△0.70±0.11*0.77±0.11**

图5 各组肺组织E-caderin、ZO-1、Claudin3的蛋白表达

3 讨论

CVA是目前儿科领域较受关注的常见疾病,近年来随着雾霾的加重,PM2.5的暴升,CVA在我国儿童的发病率呈急剧上升趋势,除了发病率高,易转化为典型哮喘外,最新研究发现,CVA患儿比典型哮喘更易出现情绪低落、焦虑、抑郁等心境变化[9],严重影响着患儿及其家庭的生活质量。因此,探索CVA潜在发病机制,开创有效的治疗策略,有着积极而重要的临床意义和社会意义。

CVA为Th1/Th2免疫失衡,Th2炎症反应占优势的气道免疫炎症性疾病[10]。在变应原和病原微生物的刺激下,气道上皮细胞损伤后可释放多种细胞因子和炎性介质,其中,细胞因子IL-33和TSLP是CVA Th2型炎症反应启动的重要因素[11]。来源于上皮的细胞因子IL-33和TSLP可促进下游树突状细胞OX40L与CD4+T细胞膜上的OX40结合,使得CD4+T细胞向Th2亚群分化,上调Th2细胞因子的比例,增强Th2型免疫应答[12-13]。本次研究通过ELISA法检测肺组织中IL-33和TSLP的含量,发现CVA模型组气道组织IL-33和TSLP明显升高,而中药组可以显著抑制IL-33和TSLP的表达,且与模型组之间差异具有统计学意义;提示加味芎蝎散可能通过抑制Th2型细胞因子IL-33和TSLP的表达,缓解下游的免疫炎症反应。

上皮连接功能减弱或丧失是气道上皮损伤的重要原因之一,E-caderin、ZO-1、Claudin3是发挥上皮屏障功能的重要细胞间连接蛋白。E-caderin是一类钙离子依赖性跨膜糖蛋白,作用是保持上皮细胞间的粘附状态,维持组织完整。既往研究表明,E-caderin在大多数炎症中的表达均呈下调趋势。近年来研究发现,E-caderin在哮喘患者及大鼠模型中的表达均明显降低[14-15],说明E-caderin可能与支气管哮喘的发生发展有关联。ZO-1和Claudin3等构成紧密连接蛋白复合物,在哮喘中亦表达下调。大量研究推测了连接蛋白对于哮喘发生及进展可能的机制:上皮连接蛋白表达下降后,上皮连接功能受损,支气管上皮细胞发生上皮-间质转化,获得了某些间质细胞表型,从而造成了气道重塑[16-17]。本次研究发现,CVA模型组中3种细胞连接蛋白表达均明显下调,而中药组和孟鲁司特钠组均有明显的提高连接蛋白表达的作用,说明加味芎蝎散可能通过上调连接蛋白,维持细胞完整和上皮的屏障功能,抑制上皮细胞分泌Th2型细胞因子,达到缓解炎症的作用。

芎蝎散出自宋代陈文中《小儿病源方论》,原方组成为川芎、荜茇各1两,蝎稍去毒尖1钱,细辛、半夏各2钱。万全在《幼科发挥》中用芎蝎散治疗“气喘息急,呕吐痰涎”者。CVA历来是中医治疗的特色项目和优势病种。本文作者徐荣谦主任医师在本病的发病机理中十分注重风邪,同时,他又认为,在CVA的发展过程中瘀阻肺络也有重要的致病作用。故以芎蝎散为基础,加白前、五味子、芦根,组成加味芎蝎散。前期研究证实加味芎蝎散具有抗炎、抑制血管新生和细胞迁移作用。

本次研究结果显示,加味芎蝎散能够有效减轻CVA模型大鼠肺组织气道炎症程度,降低气道黏膜上皮变性及损伤,在进一步的免疫组化和Western blotting实验中均证明,中药干预后,上皮连接相关蛋白的表达较模型组均有大幅提高。我们假设:加味芎蝎散能够提高上皮连接相关蛋白的表达,稳定了细胞间连接,从而改善了气道的上皮屏障功能,继而也削弱了哮喘的免疫炎症反应。该发现将为我们明确CVA黏膜上皮结构功能改变以及加味芎蝎散治疗CVA的作用机制提供研究基础。

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