凯氏定氮法与杜马斯燃烧法检测饲料粗蛋白质含量的比较

梁世岳， 李海花， 陈龙宾， 陈丽丽， 李玉鹏， 杨鸿雁*

（1.天津市畜牧兽医研究所，天津 300381；2.天津农学院动物科学与动物医学学院，天津 300384）

粗蛋白质是饲料重要的营养成分之一，是畜禽生长发育必需的营养物质。蛋白质一般由碳、氢、氧、氮四种元素构成，其中氮是蛋白质中含量最稳定的元素，平均含量为16%，所以测定蛋白质含量通常只测定氮元素含量（张妍妍，2013）。畜牧行业采用由饲料中含有的氮元素含量乘以蛋白质转化系数（常以6.25来表示）所得到的数据来推算饲料中蛋白质的含量，即通常所说的粗蛋白质。因此，饲料中粗蛋白质的检测本质就是饲料中氮元素的检测。目前，我国饲料粗蛋白质的国家标准检测方法主要采用凯氏定氮法（李仲玉和杜娟，2017）。

凯氏定氮法是Kjeldahl于1883年提出的定氮方法（张清建，1995）。这种方法精确可靠，具有良好的精密度和重复性，设备成本较低，我国多采用此法。但是该方法操作步骤繁琐,消耗时间长，对操作人员要求较高，测定结果受人为因素影响较大，操作中使用大量腐蚀性强酸、强碱，有一定的危险性，并且检测过程会产生有毒有害气体，既危害人体健康又造成环境污染。杜马斯燃烧定氮法通过高温燃烧将氮元素转化为氮氧化合物进行定量，无需任何化学试剂，仪器自动进样和计算结果，是一种快速、低成本、自动化高的定氮方法。本实验采用凯氏定氮法与杜马斯燃烧定氮法同时测定饲料样品，对检测方法和检测结果进行比较分析，以期找到一种能准确、简捷、快速、无污染测定饲料粗蛋白质含量的有效方法。

1 材料与方法

1.1 实验原理

1.1.1 凯氏定氮法 催化剂条件下用浓硫酸高温消煮，将饲料中的有机氮转换为铵态氮并与硫酸结合为硫酸铵，通过强碱蒸馏来确定全氮含量（许超，2018）。 凯氏定氮法是一个氧化还原反应，把低价氮氧化并转为氨盐来测定，但不能把高价氮还原为氨盐的形式，所以不能测出物质中所有价态的氮含量（周航等，2009），比如硝基氮和亚硝基氮，导致某些样品的检测结果偏低。

1.1.2 杜马斯燃烧定氮法 样品在900～1200℃纯氧高温下燃烧，产生的混合气体中氮氧化物被全部还原成分子氮，被热导检测器检测（范志影和刘庆生，2007），经独立校正后自动计算出来，乘以相应的转换系数即为粗蛋白质含量，每个样品4～6 min即可完成（赵玉富，2013）。杜马斯燃烧法能将样品所含的有机氮和无机氮全部转化成氮的氧化物后被还原剂还原成氮气进行测定 （朱国霞和哈玲津，2017）。

1.2 实验样品 从河北和天津的饲料加工厂采集包括玉米、小麦、次粉、小麦麸、玉米DDGS、菜籽粕、大豆粕、苜蓿和鱼粉等12份饲料原料作为检测样品，随机编号样品1～样品12，用FOSS旋风磨粉碎至过40目筛，得到样品量100 g左右，置于密封袋中备用。

1.3 仪器与设备 全自动凯氏定氮仪 （型号为FOSS 2300）；消化炉（型号为 FOSS 2040）；旋风磨（型号为CT 410），购自丹麦FOSS公司；杜马斯燃烧定氮仪（型号为Rapid N），购自德国Elementar公司；分析天平 （型号为AE 100），购自瑞士METTLER TOLEDO公司。

1.4 试剂与耗材 混合催化剂 (每片含3.5 g K2SO4及 0.4 g CuSO4·5H2O)， 购自丹麦 FOSS 公司；硫酸（AR）、氢氧化钠（AR）、硼酸（AR）、盐酸（AR）、甲基红（AR）、溴甲酚绿（AR），购自国药集团化学试剂有限公司；氮气(≥99.99%)、氧气(≥99.999%)、氦气(≥99.999%)，购自天津泰亚气体销售有限公司。

1.5 实验设计 采用凯氏定氮法与杜马斯燃烧法同时对实验样品进行粗蛋白质含量测定，每个样品分别做2个平行测定，粗蛋白质含量在25%以上时，允许相对偏差为1%；粗蛋白质含量在10%～25%时，允许相对偏差为2%；粗蛋白质含量在10%以下时，允许相对偏差为3%。否则，需重新称样测定，直至平行样结果相对偏差符合要求为止，取平均值为测定结果。凯氏定氮法：每次消煮10个样品，消煮时间约4 h，蒸馏时间约150 m，分2次完成。杜马斯燃烧定氮法：每个样品需4～6 min，一次性完成检测，共需时间约2 h。

1.6 实验步骤

1.6.1 凯氏定氮法 称取样品0.5 g左右，精确至0.0001 g，依据GB/T 6432-1994《饲料中粗蛋白质测定方法》操作，全自动分析仪自动输出检测结果。

1.6.2 杜马斯燃烧定氮法 称取样品0.25 g左右，精确至0.0001 g，置于锡箔纸中，挤出空气、压实，紧密包裹后置于自动落样器，仪器自动进样检测并输出结果。

1.7 数据的统计分析 采用Excel 2007对实验数据进行初步整理，用SPSS 22.0统计软件进行配对样本T检验，以P＜0.05作为差异显著性判断标准。

2 结果与分析

2.1 凯氏定氮法与杜马斯燃烧定氮法检测结果由表1可知，样本粗蛋白质含量为7.88%～69.46%，跨越区间较大，代表性较强。两组检测结果的相对偏差基本都在2%以下，标准差都在0.60%以下，均符合国家标准《饲料中粗蛋白质测定方法》GB/T 6432-1994（国家技术监督局，1994）的要求。

2.2 凯氏定氮法与杜马斯燃烧定氮法检测结果统计分析 由表2可知，两组数据的差值为-0.86% ～0.29%、比值为98.76% ～101.10%，检测结果基本一致；两组数据经配对样本t检验，P＞0.05，表明凯氏定氮法与杜马斯燃烧定氮法对样品的测定结果无明显差异。

表1 凯氏定氮法与杜马斯燃烧定氮法检测结果 %

表2 凯氏定氮法与杜马斯燃烧定氮法检测结果的统计分析%

2.3 凯氏定氮法与杜马斯燃烧法的比较

2.3.1 样品要求比较 凯氏定氮法可以测定所有形态的样品，固态样品要求粉碎至过40目筛即可。杜马斯燃烧法不能直接检测液体样品，对于复杂样品分析难度较大，要求样品是均匀粉末，由于称样量较小，样品细度要求较高，一般过100目筛，以利于所称样品具有代表性。

2.3.2 称样量比较 凯氏定氮法称样量，一般以0.4～ 0.5 g为宜；杜马斯燃烧法称样量为0.25 g以下，对于密度小体积较大的样品，称样量应低于0.2 g，以确保其锡箔纸包，能顺利进入样品孔。凯氏定氮法对样品的称样量要求相对宽松，而杜马斯燃烧法要求较严格，由于进样孔径的限制，要求称样量与进样孔径相匹配，以免检测失败。

2.3.3 检测时间比较 凯氏定氮法称样后需要消解和蒸馏步骤，一次可消解样品10个左右，检测过程需1～2 d；杜马斯燃烧法称样后可直接进样即时测定，每个样品只需4～6 min就能得到检测结果。

2.3.4 环境污染和安全性比较 凯氏定氮法检测过程中使用浓酸、浓碱，产生大量含有化学污染物的废气、废液，对人体和生态环境危害较大。杜马斯燃烧法不使用化学药品，且不会产生有毒有害的废液、废气，安全性较高。

2.3.5 检测人员比较 凯氏定氮法检测人员需经过严格培训和系统学习实验室检测知识，熟练掌握操作技能，整个检测过程需检测人员认真操作完成。杜马斯燃烧法无需人员在场，仪器自动完成检测过程。

2.3.6 检测成本比较 凯氏定氮法使用大量化学试剂及玻璃器具，检测过程需要保持冷凝水供给，电能和水源耗费较多。杜马斯燃烧法不需化学试剂及器具，不需冷凝水，几分钟即可完成检测，耗电少，检测成本较低。

2.3.7 测定结果比较 表1和表2说明两方法均具备良好的稳定性和重复性，且两种检测方法的检测结果基本一致，经配对样本t检验，P＞0.05，说明两种检测方法的检测结果差异不显著。

3 讨论与结论

凯氏定氮法与杜马斯燃烧法测定结果的相对偏差都在2%以下；差值为-0.86%～0.29%；比值为98.76%～101.10%；经配对样本t检验，P＞0.05；说明两种方法均具有良好的稳定性和重复性且检测结果差异不显著，均能正确检测样品的粗蛋白质含量。

凯氏定氮法所用仪器价格低廉，即使在很小的实验室也可以用简单的凯氏定氮装置实现蛋白质的测定，但检测时间长，检测成本高，工作量大，不适合大量样品的检测，检测效率较低；检测过程中常有试剂挥发，易对检测人员身体造成伤害和环境污染。杜马斯燃烧定氮法操作简易方便，自动化程度高，大大缩短了检测时间，无需化学试剂和冷凝水，降低了检测成本，检测效率较高；由于整个检测过程没有有毒有害物质产生，操作人员不用担心化学试剂对身体的伤害，也减少了环境污染，安全性较高。因此，杜马斯燃烧定氮法符合当前社会的需要，是值得推广的一种粗蛋白质检测方法。

由于实验原理不同，凯氏定氮法只能测出部分硝态氮，对于含有硝酸盐的样品，测定结果影响较大，而杜马斯燃烧法能够将样品中的氮元素完全检测出来。以鱼粉样品为例，凯氏定氮法的测定结果比杜马斯燃烧法低约1个百分点，杜马斯燃烧法对样品要求较高，不能检测液态样品，对于复杂样品的分析效果欠佳，具有一定的局限性。杜马斯定氮仪由于其较高的技术含量，仪器价格比较昂贵，从而限制了其在小型饲料厂的推广应用。