饲料中纤维素酶活力的测定方法研究

张晓丽，吴望君，袁 璐，陈 凯

（浙江省兽药饲料监察所，浙江杭州 311199）

纤维素酶是一种多组分的复合酶，能将纤维素、半纤维素降解成有利于动物胃肠道消化吸收的小分子物质，从而提高饲料营养价值及转化率。目前，饲料中纤维素酶的测定方法主要有还原糖法（Ghose，1987）、CMC 黏度法（Jecfa，2000）。NY/T 912-2004《饲料添加剂纤维素酶活力的测定分光光度法》是利用纤维素酶水解羧甲基纤维素，生成具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖，这些还原性糖与DNS试剂在水浴条件下发生显色反应，反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖的浓度成正比，因此可以通过分光光度法测定还原糖的生成量来计算纤维素酶活力（僬仕彦等，2004）。该方法操作简单，且结果重复性好，被广泛使用。但在使用过程中发现，该标准的测定方法及计算公式对于样品本底中的葡萄糖无法准确扣除。因此，本研究对计算公式进行重新编辑，对方法进行了一定的改进，以期为还原糖法测定饲料中的纤维素酶活力提供参考。

1 材料与方法

1.1 试剂 0.1 mol/L HAc-NaAc缓冲溶液 （pH 5.5）；DNS试剂：称取 3，5二硝基水杨酸 3.15 g，加水500 mL后水浴至45℃，加氢氧化钠（200 g/L）100 mL、四水酒石酸钾钠 91.00 g、苯酚 2.50 g、无水亚硫酸钠2.50 g，溶解后定容至1000 mL，储存在棕色瓶中，避光保存；0.8%（m/V）羧甲基纤维素钠水溶液 （CMC-Na，Sigma 公司生产）；10.0 mg/mL葡萄糖标准溶液；待测酶液：称取酶样适量于250 mL锥形瓶，准确加入100 mL缓冲溶液振摇 30 min，放置1 h后摇匀，取部分溶液离心，上清液二次稀释至合适浓度（0.04～0.06 U/mL），供测定使用。

1.2 仪器 TU 1901紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。

1.3 试样空白的制备 吸取2.00 mL经过适当稀释的酶液（已37℃平衡10 min），加入到刻度试管中，再加入5.00 mL DNS试剂，电磁振荡3 s。然后加入2.00 mL羧甲基纤维素钠溶液（已37℃平衡 10 min），37 ℃保温 30 min，加入 0.3 mg/mL 葡萄糖溶液1.00 mL，混匀，沸水浴加热5 min。用自来水冷却至室温，加水定容至25 mL，涡旋3 s，作为试样空白。

1.4 样品的制备 吸取2.00 mL经过适当稀释的酶液（已37℃平衡10 min），加入到刻度试管中，再加入2.00 mL羧甲基纤维素钠（已37℃平衡 10 min），涡旋 3 s，37 ℃精确保温 30 min。加入5.00 mL DNS试剂，电磁振荡3 s，以终止酶解反应，加0.3 mg/mL葡萄糖溶液1.00 mL，混匀，沸水浴加热5 min，用自来水冷却至室温，加水定容至25 mL，电磁振荡3 s。以标准空白样为空白对照，在540 nm处测定吸光度。

2 实验结果与分析

2.1 计算公式的讨论

原农业标准酶活力计算公式为：

原农业标准的公式等同于以试样空白调零测试样溶液，仅适用于试样本底葡萄糖浓度为零的情况，而样品本底中葡萄糖浓度是否为零无法通过吸光度判断。建议修改为：

式中：X为试样的纤维素酶活力，U/g；CE为从标准曲线上回归的酶反应液的葡萄糖浓度，mg/mL；CB为从标准曲线上回归的酶空白样的葡萄糖浓度，mg/mL；V为样品总稀释倍数；M为葡萄糖的摩尔质量[M（C6H12O6）=180.2 g/mol]；t为酶解反应时间，min；m 为称样量，g。

2.2 葡萄糖标准曲线及定量限 吸取乙酸-乙酸钠缓冲液5.0 mL，加入DNS试剂5.0 mL，沸水加热5 min，用自来水冷却至室温，用水定容至25 mL，制成标准空白溶液。

分别吸取葡萄糖标准溶液 100、200、300、400、500、600、700 μL， 分别用乙酸-乙酸钠缓冲溶液定容至10 mL。

分别吸取上述浓度的葡萄糖标准液各2.00 mL，置刻度试管中，各加入3.00 mL乙酸-乙酸钠缓冲液和5.00 mL DNS试剂，振摇3 s。沸水浴加热5 min，用自来水冷却至室温，加水定容至25 mL，摇匀。以标准空白溶液调零，在540 nm处测定吸光度A，以葡萄糖浓度为Y轴、吸光度A值为X轴，绘制标准曲线（不同批次的DNS配置的标准曲线略有差异），见图1。称样量为 10 g，酶稀释液浓度为 0.04 U/g，按 1.1步骤处理，定量限为0.8 U/g。

2.3 标准曲线对样品空白实验回归准确性的研究 由图1可知，当A=0时，回归曲线的葡萄糖浓度为0.108 mg/mL，不能准确反映样品本底中葡萄糖的准确浓度。为此，尝试了三种方法。

图1 纤维素酶活力测定标准曲线

2.3.1 DNS中添加葡萄糖对测定结果的考察JECFA（2000）标准方法中，在DNS溶液中添加了30μg/mL乳糖，从而使标准曲线尽可能通过原点。以此为参考，在DNS溶液中添加不同浓度的葡萄糖制定标准曲线，对不同浓度的葡萄糖溶液进行回归测定。由表1可知，当溶液中葡萄糖浓度≤80μg/mL，DNS中添加不同浓度的葡萄糖，结果都不能准确测定溶液中葡萄糖浓度，因此不考虑在DNS中添加葡萄糖的方法。

表1 DNS溶液中添加不同浓度的葡萄糖考察结果mg/mL

2.3.2 DNS溶液加入量对测定结果的考察 国内标准方法中，DNS溶液的反应量从3/25～4/6（DNS加入量/最终定容体积）。按照表2配制酶反应体系，用标准曲线对不同含量的葡萄糖溶液进行回归测定。结果显示（见表3），加入不同量的DNS，100μg/mL浓度以下的葡萄糖仍不能准确回归，因此不考虑改变DNS的添加量。

表2 酶反应液各溶液配比

表3 葡萄糖含量测定结果mg/mL

2.3.3 试样空白溶液和试样溶液中添加葡萄糖对测定结果的考察 为提高试样空白溶液测定响应值，在试样溶液及试样空白溶液37℃保温30 min且与DNS反应后，在反应液中分别添加不同浓度的葡萄糖1 mL，按农业标准方法操作，进行上机测定，结果见表4。由表4可以看出，试样溶液及试样空白溶液与DNS反应结束后，添加1 mL浓度为0.2～0.6 mg/mL的葡萄糖时，测得的试样溶液及试样空白溶液中的葡萄糖上机浓度较稳定，所测的酶活力RSD为1.9%。考虑到添加0.2 mg/mL葡萄糖时，样品空白吸光度约为0.010，响应值低 （对于新配置DNS，吸光度响应会更低），当添加浓度过大时，极易造成试样溶液的总浓度超出曲线范围，因此试样溶液及试样空白溶液中葡萄糖的添加浓度确定为0.3 mg/mL，添加量为1 mL。当测得的试样空白溶液中葡萄糖浓度大于0.35 mg/mL且试样反应液中葡萄糖浓度超过标准曲线范围时，可用1 mL乙酸-乙酸钠缓冲溶液代替0.3 mg/mL葡萄糖溶液。

2.4 酶液浸提时间对酶活力的影响 对三个不同的样品进行提取，4℃浸提不同时间的试样进行双份稀释，稀释液摇匀后测定，结果见图2。结果表明，不浸提时，酶液不能充分溶出，样品相对偏差较大；当浸提时间为1～24 h，酶活力变化差异为2.0%～3.4%，考虑到时间成本，建议浸提时间为1 h。

表4 试样空白溶液和试样溶液中添加葡萄糖的考察结果

图2 4℃浸提不同时间的酶活力

2.5 参加酶反应时试样溶液浓度的考察 由表5可以看出，参加酶反应时试样的酶活力对样品活力的测定影响较大，当待测酶液活力为0.043～0.08 U/mL时，仅稀释倍数造成的测定相对偏差就达到了10.0%，超过了标准规定的8%，建议缩小待测酶液的活力范围为0.04～0.06 U/mL。

表5 待测酶液酶活力对测定结果的影响（n=3）

2.6 与农业标准比较 分别采用文章中的方法、公式与农业标准对不同样品 （样品5由样品2稀释酶液中添加0.15 mg/mL葡萄糖，不考虑葡萄糖对酶解反应的影响，二者酶活力一致）进行测定比较，结果见表6和表7。采用本方法测定时，样品测定重复性好，RSD为3.6%～5.0%，且对样品2和样品5的测定可得到相近的数值，二者的相对偏差为1.7%，而采用NY/T 912-2004方法测定时，样品2与样品5相差较远，相对偏差为12.1%，由此发现新建的方法能够较准确的测定样品空白的葡萄糖浓度，从而更准确的反映酶活力。

表6 本文建立的方法测定的纤维素酶活力

表7 按NY/T 912-2004方法测定的纤维素酶活力

3 结论

本实验结果表明，样品4℃浸提1 h即可充分提取；稀释酶液浓度为0.04～0.06 U/mL时可较好的控制样品测定的稳定性；通过试样溶液及试样空白溶液37℃酶解反应结束后添加1 mL 0.3 mg/mL的葡萄糖溶液，可提高试样溶液及试样空白溶液的葡萄糖浓度，从而解决了试样空白溶液中葡萄糖浓度测定不准的问题，同时对计算公式进行重新编辑，使得酶活力测定更加精准。

对于试样稀释液中葡萄糖浓度已经较高的样品，即试样空白中葡萄糖浓度大于0.5 mg/mL的样品，其试样反应液中葡萄糖浓度会超过0.7 mg/mL，超出标准曲线范围，导致测定不准，可参考杨海峰（2014）等的方法，先用渗透膜法降低试样中葡萄糖浓度再进行测定，或采用罗长才（2011）等研究的琼脂糖扩散法进行测定，也可采用黏度法进行测定。