ELISA与HPLC-MS对饲用玉米中2种霉菌毒素的比较分析

钟兴文， 王炳彦， 陈 琛， 杨旭艳 ， 杨秀娟，陈 莹， 孙照程， 华雪妃， 孔凡虎， 章雨竹， 陶琳丽*

（1.云南农业大学动物科学技术学院，云南省动物营养与饲料重点实验室，云南昆明 650201；2.牟定县新桥镇畜牧兽医站，云南楚雄675501；3.大理白族自治州动物卫生监督所，云南大理 671000）

赤霉烯酮（ZEA）是一种非类固醇的具有雌激素效应的镰刀菌毒素，主要污染玉米、小麦、大麦等谷物作物，毒素可作用于畜禽的生殖系统，引起雌性动物产生雌激素过多综合征和严重的生殖道症状及不孕症，同时会对动物机体产生遗传毒性、免疫毒性、细胞毒性和致肿瘤毒性（祭芳等，2019；姜淑贞等，2011）。T-2毒素也是污染我国饲料原料的主要霉菌毒素之一，被列为最危险的天然污染源之一，主要表现为基因毒性、细胞毒性和血液毒性，能够通过食物链的传递和生物体的蓄积作用，污染谷物及其制品，进而对畜禽及其产品的安全性甚至人体健康构成严重威胁（薛山等，2013）。大量研究表明，ZEA和T-2毒素在我国玉米中有很高的污染率，且这两种毒素对畜禽生产和人类自身都有巨大的危害（杜妮，2018；梁琛等，2017）。因此，加强对玉米中ZEA和T-2毒素的监测有利于保障生产者和消费者的切身利益，对饲料工业、畜牧业和农业的可持续发展也有着重大意义。

目前霉菌毒素的检测方法主要有生物学方法、免疫学方法和化学仪器分析法等，根据检测效率的快慢，又可分为快速方法和确认方法（Agag，2004）。快速筛选霉菌毒素的方法以酶联免疫（ELISA）法较为常用，该法具有操作简单方便、成本较低、检测快速等优点，适合大批量样品的快速检测，但因所需抗原、抗体灵敏度较高，易出现假阳性反应，导致检测结果不准确。而确认方法主要基于色谱法，如气相色谱法（Tarter等，1991）、高效液相色谱法（梁雄宇等，2011）、液相色谱-串联质谱联用法等 （赵孔祥等，2011；Beltran等，2009）。高效液相色谱-串联质谱联用（HPLC-MS）法集高效分离和多组分定性和定量检测于一体，是理想的检测方法，逐渐成为霉菌毒素检测的主流方向，但对检验人员的技术要求较高 （王瑞国等，2015）。基于检测霉菌毒素的重要性，本研究采用ELISA和HPLC-MS对饲用玉米中的ZEA和T-2毒素进行检测，旨在比较两种方法对饲用玉米中ZEA和T-2毒素的检测效果。

1 材料与方法

1.1 样品采集与制备 在多家饲料厂采集饲用玉米30份。采集方法严格按照 《饲料采样法》（GB/T14699.1-2005）的要求，用四分法缩减取200 g，用粉碎机粉碎后过40目筛，混匀装入自封袋中备用，样品在测定前于-20℃冰箱中密封保存。

1.2 主要仪器 ST-360酶标仪 （上海科华实验系统有限公司）；TSQ QUANTIVA高效液相色谱—串联质谱仪 （Thermo Scientific）；300 g摇摆式高速万能粉碎机 （温岭市林大机械有限公司）；SHA-B恒温振荡器（常州智博瑞仪器制造有限公司）；H2050R高速冷冻离心机 （湘仪离心机有限公司）。

1.3 主要试剂 甲醇、乙酸、甲酸、乙腈，均为色谱纯，购自天津市光复有限公司；氯化钾、氯化钠、磷酸二氢钾、十二水合磷酸氢二钠、吐温-20、盐酸、氢氧化钠，均为分析纯，购自天津市风船化学试剂科技有限公司；玉米赤霉烯酮标准品和T-2毒素标准品，购自国家标准物质中心；黄曲霉毒素B1/玉米赤霉烯酮/T-2毒素三合一免疫亲和柱，购自北京华安麦科生物技术有限公司；ELISA试剂盒，购自北京龙科方舟生物工程有限公司。

1.4 酶联免疫法 ZEA预处理：称取（5±0.1）g制备的玉米样品于50 mL离心管中，加入25 mL 70%甲醇溶液，在恒温振荡器（200～300 r/min）上充分振荡提取3 min，静置后取上清液，4000 r/min离心5 min，向900μL ZEA样品稀释液中加入离心后的上清液100μL，混匀待检；T-2预处理：同ZEA处理，最后一步改为向950μL的T-2毒素样品稀释液中加入离心后的上清液50μL，混匀待检。将ZEA和T-2毒素的待检样品按照各自的试剂盒方法进行操作，最后在酶标仪450 nm/630 nm双波长下检测其吸光度，然后根据样品的百分吸光度计算ZEA和T-2毒素的含量。ELISA法对ZEA和T-2毒素的检出限分别为25μg/kg和 20μg/kg。

1.5 高效液相色谱-串联质谱联用法 参考NY/T 2071-2011《饲料中黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和T-2毒素的测定 液相色谱-串联质谱法》进行测定，其过程是利用试样中的霉菌毒素经乙腈溶液提取，正己烷脱脂及霉菌毒素多功能净化柱净化后，氮气吹干，甲酸乙腈溶液复溶，用液相色谱-串联质谱法测定，采用色谱保留时间和质谱碎片及其离子丰度比定性，外标法定量。HPLCMS法对ZEA和T-2毒素的检出限分别为5μg/kg和 1μg/kg。

1.5.1 样品预处理 样品提取：称取（5±0.01）g玉米样品于50 mL离心管中，加入25 mL 80%乙腈-水溶液（乙腈∶水=80∶20）提取，在恒温振荡器（250 r/min）上剧烈振荡 20 min，然后 4000 r/min离心5 min，取5 mL离心后的上清液加入35 mL稀释液稀释，混匀，取20 mL滤液过柱。样品净化：取出接近室温的免疫亲和柱，将20 mL注射器的下端直接穿透亲和柱上方的塞子，完成注射器筒与亲和柱的连接，去掉亲和柱下方堵头，将其插在固相萃取装置的架子上进行固定，完成亲和柱与固相萃取装置的连接，在注射器针筒内装上20 mL滤液，调节固相萃取开关，使滤液以1～2滴/s的速度流出，待液体排干后，先用10 mL洗涤液（0.1%Tween-20水溶液）洗涤一次，排干；再用10 mL超纯水洗涤一次，流速为2～3滴/s；待液体排干后，关闭固相萃取开关。样品洗脱：在亲和柱内加入 2 mL洗脱液（甲醇：乙酸=98：2），静置 3 min后，以1滴/秒速度洗脱，用10 mL的玻璃试管收集洗脱液，调节氮吹仪的参数，控制适宜的氮气流速，在50℃的氮气下吹干洗脱液，用1 mL甲酸乙腈（1∶1）溶液复溶，再用涡旋振荡器振荡5～10 min使霉菌毒素和复溶液充分溶解，用1 mL注射针筒吸出溶解液，过0.22μm的有机滤膜，装瓶上机。

1.5.2 液相色谱条件 色谱柱：C18柱 （长度50 mm，内径1.9μm）；流动相：0.1%的甲酸溶液和1∶1的甲醇乙腈溶液；流速：0.3 mL/min；柱温：33℃；进样量：5μL；质谱检测器。流动相、流速及洗脱条件如表1和表2所示。

表1 ESI+源梯度洗脱条件

表2 ESI-源梯度洗脱条件

1.5.3 质谱条件 离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描模式和负离子扫描模式；检测方式：多反应监测；毛细管电压，模式4000 V，负模式3500 V；干燥气温度：350℃；雾化气压力：40 psi；脱溶剂气、锥孔气均为高纯氮气；碰撞气为高纯氩气。

1.6 限量标准 玉米赤霉烯酮（ZEA）和T-2毒素均参照 《饲料卫生标准》（GB13078-2017），ZEA≤500 μg/kg；T-2≤ 500 μg/kg。

1.7 数据处理 所有实验数据均用Microsoft Excel进行整理分析。

2 结果与分析

2.1 玉米赤霉烯酮的检出结果 由表3可知，使用ELISA法和HPLC-MS法对饲用玉米中ZEA的检出率均为100%，且两种方法检出结果最高的均是18号玉米样品，检出值分别为918.80μg/kg和345.01μg/kg。ELISA法检出结果最低的是11号玉米样品，含量为28.07μg/kg，对应HPLC-MS法检出值为12.97μg/kg。而HPLC-MS法检出结果最低的是17号玉米样品，含量为5.00μg/kg，对应的ELISA法检出值却为99.47μg/kg，远高于HPLC-MS法。即HPLC-MS法测定ZEA的最高、最低含量均低于ELISA法测定的结果。根据2017版的《饲料卫生标准》中ZEA的限量标准（ZEA≤500μg/kg），ELISA法检测超标数量有 3个，而HPLC-MS法则无超标样品。两种检测方法对ZEA的检出结果相差最大的是13号玉米样品，相差值为810.06μg/kg；检出结果相差最小的是8号玉米样品，相差值为1.61μg/kg，其他玉米样品的检测结果均有不同程度差异。实验结果表明，1号、15号、20号样品的检测结果是HPLC-MS法高于ELISA法，而其他玉米样品的检测结果都是ELISA法高于HPLC-MS法。

表3 玉米赤霉烯酮的检测结果 μg/kg

2.2 T-2毒素的检出结果 由表4可知，ELISA法对饲用玉米中T-2毒素的检出率为83.33%。HPLC-MS法检出11号玉米样品的T-2毒素含量为0.48μg/kg，低于HPLC-MS法的检出限，相当于未检出，并且也远小于对应的ELISA法检出的结果62μg/kg，而其余的玉米样品则都没被检测到。使用ELISA法检测饲用玉米样品中T-2毒素含量最高是1号样品，含量为124.6μg/kg，对应的HPLC-MS法却未检出。两种检测方法下，13号、14号、21号、23号、24号玉米样品未检出T-2毒素。根据2017版的《饲料卫生标准》中T-2的限量标准 （T-2≤500μg/kg），发现ELISA法和HPLC-MS法对饲用玉米中T-2毒素含量的检测结果显示均未超标。结果表明，ELISA法对饲用玉米中T-2毒素的检出结果均大于HPLC-MS法，且ELISA法的检测结果也相对较低。

3 讨论

本研究中采用ELISA法和HPLC-MS法检测ZEA的检出率均为100%，而蒋玉寒（2015）、杨晓飞（2007）、王若军（2003）等研究不同地区的玉米中ZEA也是100%检出，这说明了我国大部分地区的玉米普遍被ZEA污染。李玲（2017）检测玉米副产物中ZEA的情况与本研究结果一致，侯真真（2018）在干酒槽、蛋白粉、高粱等鸡饲料原料中也有不同程度的检出ZEA，证实ZEA对谷物类作物污染广泛，且在实际生产中难以消除，人们应该加强对ZEA的监测。ELISA法检测玉米样品中T-2毒素时的检出率为83.33%，但检出含量相对较低，无超标样品，而HPLC-MS法的检出率几乎为零。

在本实验中，两种方法检测玉米中ZEA、T-2毒素时得到的结果都存在差异，ELISA法检测出的结果普遍高于HPLC-MS法检测的结果。影响ELISA法测定结果的原因有以下几个方面：（1）样品预处理可直接影响霉菌毒素的分析灵敏度和准确度，选择合适的溶剂才能确保最大程度的提取到霉菌毒素。陈建伟（2012）以玉米为试材发现，甲醇浓度对ELISA测定结果影响最为显著，其次是提取溶液体积和提取时间以及温度。（2）ELISA法不能把玉米样品中的脂肪、重金属离子除去，而重金属离子的存在会破坏酶的活性，使酶底物加入后显色偏浅，易出现假阳性；或是脂肪吸附在包被抗体孔中阻碍了样品液抗原与抗体的结和，也会造成假阳性（乙小娟等，2000）。（3）由于提取液甲醇易挥发，制成样品液时不易控制其pH，样品液的pH过高、过低都会影响检测结果。陈玲（2006）研究发现，当样品提取液pH低于5时，酶标抗原中酶的结构发生不可逆的变化并丢失其大部分活性，导致显色反应时颜色偏浅，使结果出现假阳性。玉米样品液的pH应在6～8为宜，若偏离此范围要用盐酸或氢氧化钠调节pH。（4）霉菌毒素之间有共同污染的现象（周建川等，2018；龚阿琼，2017）。本实验检测的ZEA和T-2毒素可能与其他毒素也有交叉反应的现象。（5）霉菌毒素在不同试剂盒方法中的预处理方法、数据处理方式以及毒素的回收率、检出限及检测范围等的差异都会对测定结果造成影响。HPLC-MS法是较为理想的检测，不存在交叉反应和假阳性的问题，已被广泛应用，是检测霉菌毒素方法中较为权威的 （王瑞国，2015）。但对实验员的操作要求较高，若在前处理过程中操作不当，如毒素洗脱不完全、氮气吹的过多，使样品中霉菌毒素含量减少，导致检测结果偏低；还有HPLC-MS法的检测时间较长，可能会使待测毒素发生氧化，影响测定结果。

表4 T-2毒素的结果μg/kg

综上所述，玉米中的霉菌毒素用ELISA法检测的结果普遍高于HPLC-MS法，HPLC-MS法则是结合了液相色谱的高分离度、高灵敏性和质谱检测器的通用性、可知分子结构、选择性好等优点，检测玉米中霉菌毒素时测定结果较为稳定和准确。因此，在实际生产应用中，相关人员可根据不同的检测目的选择不同的检测方法，或者是先采用ELISA法进行初筛，样品呈阳性之后，再采用HPLC-MS法进行分析验证，这样得到的结果较为可靠又有实际意义。

4 结论

本实验采用两种检测方法对饲用玉米中ZEA和T-2毒素的检测结果显示，ELISA法检测的结果普遍高于HPLC-MS法。但根据两种检测方法的优缺点，检测饲用玉米中的ZEA和T-2毒素时，适合用ELISA法初筛，检测结果呈阳性之后，再用HPLC-MS法进行精确定量。