基于氨基酸类成分的胃可宁片HPLC指纹图谱研究

沈丹萍 张正光 詹常森

摘 要 目的：建立胃可宁片高效液相色谱指纹图谱，为其质量控制提供比较全面的方法。方法：采用异硫氰酸苯酯（PITC）为衍生试剂，与胃可宁片中氨基酸等化合物柱前衍生，高效液相色谱法测定，Venusil AA（4.6 mm×250 mm， 5 mm） 作为色谱柱，柱温 40 ℃，流速为 1.0 ml/min，检测波长 254 nm，用流动相A[乙腈-水（80∶20）]和B [0.1 mol/L醋酸钠水溶液（pH 6.5）]的混合液进行梯度洗脱。 结果：建立了胃可宁片指纹图谱方法，确定了 12 个共有峰，10 批样品的相似度均大于 0.95，同时分析了共有峰的来源。结论：该方法准确可控，可用于胃可宁片的质量控制和评价。

关键词 胃可宁片 氨基酸 柱前衍生化 指纹图谱

中图分类号：O657.72； R286 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2019）15-0108-05

Study on HPLC fingerprint of Weikening tablets based on amino acids

SHEN Danping1， 2*， ZHANG Zhengguang1， 2， ZHAN Changsen1， 2**（1. Shanghai Hutchison Pharmaceuticals Co.， Ltd.， Shanghai 201401， China； 2. Shanghai Engineering Research Center for Innovation of Solid Preparation of TCM， Shanghai 201401， China）

ABSTRACT Objective： To establish HPLC fingerprint of Weikening tablets to provide a comprehensive evaluation for their quality control. Methods： HPLC determination was performed on a Venusil AA column （4.6 mm×250 mm， 5 mm）at column temperature 40 ℃， flow rate 1.0 ml/min and detection wavelength 254 nm by gradient elution with mobile phase A（acetonitrile-water （80：20）） and B （0.1 mol/L sodium acetate buffer solution （pH 6.5）） after pre-column derivatization of amino acids in Weikening tablets with phenyl isothiocyanate （PITC） was completed. Results： The HPLC fingerprint of Weikening tablets was established and twelve peaks of amino acids were selected as the common peaks of fingerprint for Weikening tablets. The similarity of ten batches of Weikening tablets was all more than 0.95. At the same time， the source of these common peaks was elucidated. Conclusion： This method is accurate and controllable， and can be used for the quality control and evaluation of Weikening tablets.

KEy WORDS Weikening tablets； amino acids； pre-column derivatization； fingerprint

胃可寧片是上海和黄药业有限公司独家品种之一，是在传统古方“乌贝散”的基础上，由上海中药制药一厂与上海市一、香山、仁济、中山、华山等家医院协作，经临床验证、对照、研制成功的一种治疗胃部疾病的药物。经临床证实，胃可宁片具有收敛、制酸、止痛作用，可用于胃病泛酸、胃及十二指肠溃疡。

胃可宁片主要有两味药材，珍珠层粉和浙贝母。其中，珍珠层粉为蚌科动物三角帆蚌[Hyriopsis cumingii（Lea）]、褶纹冠蚌[Cristaria plicata （Leach）]或珍珠贝科动物马氏珍珠贝[Pteria martensii （Dunker）]的贝壳内壁磨成粉，性味咸寒，其主要成分为钙，多种氨基酸和少量微量元素[1-4]。浙贝母为百合科植物浙贝母（Fritillaria thunbergii Miq.）的干燥鳞茎，性味苦寒，其主要成分为生物碱，皂苷类和多种氨基酸等[5-7]。目前缺乏对胃可宁片质量控制方法，氨基酸为珍珠层粉和浙贝母共有成分且含量较高的化合物，同时氨基酸是人体主要的营养物质及生命物质。因此，有必要主要针对氨基酸类成分建立胃可宁的指纹图谱方法，以便可用于对胃可宁片中氨基酸类成分进行有效的质量控制，防止生产过程中掺假、掺杂现象，为进一步控制胃可宁片的质量控制提供依据。

1 材料和方法

1.1 仪器与试剂

Agilent 1100高效液相色谱仪，配备四元泵，自动进样器、柱温箱、DAD检测器（美国Agilent 公司）； SB-5200超声波清洗仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）；Milli-Q 超纯水发生器（美国Millipore 公司）；数显恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）。

天门冬氨酸（Asp，批号140691-200401）、谷氨酸（Glu，批号140690-201203）、丝氨酸（Ser，批号140688-201102）、甘氨酸（Gly，批号140689-201404）、精氨酸（Arg，140685-201506）、丙氨酸（Ala，140680-201303）、亮氨酸（Leu，批号140687-201503）、苯丙氨酸（Phe，批号111615-200301）和色氨酸（Trp，批号140686-201303）对照品均来自中国食品药品检定研究院，纯度均>99%（除苯丙氨酸外）；乙腈（美国Tedia公司，色谱纯）；醋酸（色谱纯）和三乙胺（TEA，色谱纯）均购自德国CNW公司；异硫氰酸苯酯（PITC，纯度98%）购自中国上海阿拉丁试剂公司；盐酸（HCl，纯度36%～38%）和无水醋酸钠均购自上海豪申化学试剂有限公司。

1.2 样品

本实验收集了 由上海和黄药业有限公司提供的10批胃可宁片（0.53 g/片），批号分别为S1-151109、S2-160112、S3-160118、S4-160220、S5-160303、S6-160314、S7-160325、S8-160407、S9-160425、S10-160509。珍珠层粉和浙贝母各1批。

1.3 方法

1.3.1 液相条件

Venusil AA色谱柱（4.6 mm×250 mm， 5 mm），柱温40 ℃，流速为1.0 ml/min，进样量10 ml，检测波长254 nm，流动相为 A相（乙腈-水 80∶20），B 相（0.1 mol/L醋酸钠水溶液，用醋酸调pH=6.5），梯度洗脫程序：0～15 min，0%～8%（A）；15～25 min，8%～22%（A）；25～36 min，22%～36%（A）；36～38 min，36%～100%（A）；38～43 min，100%（A）；43～43.1 min，100%～0%（A）；43.1～50 min，0%（A）。

1.3.2 溶液的制备

1）对照品溶液 分别精密称定天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、精氨酸、丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和色氨酸对照品20 mg，用 0.1 mol/L 盐酸溶液溶于 10 ml容量瓶中，定容，作为储备液于 4 ℃ 冰箱避光保存。分别取对照品储备液用 0.1 mol/L 盐酸溶液适量稀释，制成分别含100 mg/ml上述氨基酸的混合对照品溶液。

2）供试品溶液 精密称取胃可宁片 2 g，置于 100 ml锥形瓶中，加入 6 mol/L 盐酸溶液25 ml溶解、定容，然后置于 100 ℃ 水浴中水解 8 h，取出冷却，取水溶液 10 ml，置于蒸发皿中，100 ℃水浴浓缩至干，加入 5 ml 0.1 mol/L盐酸溶液溶解，用 0.45 mm 滤膜过滤后，滤液贮存于冰箱中，供衍生使用。准确量取样品溶液 400 ml，按照 1.3.3 项下方式衍生，用0.22 mm 滤膜的针式过滤器过滤即可。

3）阴性样品溶液 按胃可宁处方比例分别制备缺各味药材的阴性样品。精密称取缺珍珠层粉阴性样品及缺浙贝母阴性样品各2 g，按照供试品溶液制备方式得阴性溶液样品。

4）空白溶液 精密量取 0.1 mol/L 盐酸溶液 400 ml，衍生、针式过滤器过滤即可。

1.3.3 衍生方法

准确量取氨基酸标准品溶液 400 ml，分别置于 2 ml离心管中，分别加入TEA-乙腈溶液（1 mol/L）200 ml和PITC-乙腈溶液（0.1 mol/L）200 ml，摇匀、室温静置衍生 1 h；然后分别加入 800 ml 正己烷，摇匀、静置 10 min，取下层溶液 400 ml 并用水稀释到 1 ml，混匀后用针式过滤器过滤即可。

1.4 方法学考察

1.4.1 精密度

取批号151109样品制备供试品溶液，连续进样6次进行HPLC测定，以12号峰（苯丙氨酸）为参照峰，分别计算12个共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值。

1.4.2 重复性

取批号151109样品制备供试品溶液6份，分别进行HPLC测定，以12号峰（苯丙氨酸）为参照峰，分别计算12个共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值。

1.4.3 稳定性

取批号151109样品制备供试品溶液，分别于室温放置0，1，2，4，6，8 h时进行HPLC测定，以12号峰（苯丙氨酸）为参照峰，分别计算12个共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值。

2 结果

2.1 方法学考察

在精密度和重复性考察实验中，12个共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3%，表明实验的精密度和重复性均良好；在稳定性考察实验中，12个共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD也均小于3%，表明样品在 8 h内稳定性良好。

2.2 胃可宁片指纹图谱相似度评价

采用上述已建立的指纹图谱方法，对10 批胃可宁片进行指纹图谱分析，得10批样品的指纹图谱（图 1），将图谱数据导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2009版），生成了对照指纹图谱，确定了分离度较好和稳定性较高的12个共有峰（图2-A），计算共有峰的相对保留时间和相对峰面积，计算结果见表 1。不同样品相对保留时间的 RSD 均小于 0.3%；相对峰面积的 RSD在2.65%～50.03%之间。可知，各批次样品共有物质出峰时间大致相同，成分较稳定，但其量相差较大。

通过与空白对照图谱（图 2-D）与阴性样品图谱（图2-B、图2-C）对比，确定了12个共有峰的来源，其中1号峰和4号峰来源于浙贝母，5号峰来源于珍珠层粉，而其余9个峰共同来源了浙贝母和珍珠层粉。并通过与对照品图谱（图2-E）对比，确定2号峰为甘氨酸（Glu）、3号峰为精氨酸（Arg），6号峰为丙氨酸（Ala），11号峰为亮氨酸（Leu），12号峰为苯丙氨酸（Phe）。

2.3 胃可宁片指纹图谱相似度评价

通过《中药色谱指纹图谱相似度评价软件》（2009版）的计算，得到 10 批次胃可宁片样品的整体相似度（体现不同批次样品间各成分在种类及其相对含量上的相似程度）评价结果（表2），他们的相似度均大于0.95 以上，表明此指纹图谱可用于胃可宁片质量控制。

3 讨论

大多数氨基酸无芳香环等生色团，无法直接采用紫外或荧光检测器检测，目前应用较广的采用柱前衍生高效液相法。常用的衍生试剂有邻苯二甲醛（OPA）[8-9]、异硫氰酸苯酯（PITC）[10-11]、芴甲氧羰酰氯（FMOC-Cl）[12]、丹磺酰氯（Dansyl-Cl）[13]和6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯（AQC）等，但均有其各自的优缺点。参考文献后[14-15]，本实验选择 PITC 作为柱前衍生试剂，在衍生反应后用多次溶剂萃取法去除过量的衍生试剂，以防衍生试剂对色谱柱的损伤。采用此衍生试剂，成本低、灵敏、高效，且操作简单。本实验考察了衍生试剂与样品浓度用量比，分别配制了与样品浓度不同比例，范围为1∶4～3∶4，结果发现衍生试剂与样品浓度比为1∶2为最佳配比。此外考察了衍生化反应时间对产物浓度的影响，采集室温下反应40、60、90和120 min的样品，结果发现60 min效果最佳。

本实验考察了流动相pH和不同醋酸钠水溶液浓度对氨基酸的影响，对胃可宁片整体来说，因氨基酸种类不是太多，影响不是太大，综合考虑后，本研究选择了文献报道的方法[2]，即0.1 mol/L醋酸钠水溶液，醋酸调pH=6.5。

本实验采用HPLC-UV技术，PITC 作为柱前衍生试剂，基于氨基酸类成分建立胃可宁片指纹图谱，确定了12个共有峰，通过对照品确定了5个色谱峰成分，组方中各味药材的成分亦得到了体现，研究结果可为胃可宁片的质量控制提供有益的借鉴。

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