眼科粘弹剂中硫酸软骨素含量的测定

黄慧娟 乔玉洁 吴剑英

摘 要 目的：建立眼科粘弹剂中硫酸软骨素含量的测定方法，并进行方法学验证。方法：采用醋酸钠和氯化十六烷基吡啶将样品中的硫酸软骨素沉淀，用氯化钠溶液溶解后采用咔唑法测定硫酸软骨素的含量。结果：方法学验证结果表明，线性范围为30.07～150.34 μg/ml，r为0.999 5；准确度试验的9组样品平均回收率为101.40%，RSD（n=9）为0.96%；精密度试验中，12份含量测试的平均值为102.1%，RSD（n=12）为1.22%；耐用性试验中，改变条件测得的结果与正常条件下测得的含量之比为99.9%～101.4%。结论：本研究的方法线性良好，准确度、精密度和耐用性均符合标准，可用于眼科粘弹剂中硫酸软骨素含量的检测。

关键词 眼科粘弹剂 硫酸软骨素 含量

中图分类号：R988.1； R927.2 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2019）15-0113-03

Determination of chondroitin sulfate content in ophthalmic viscosurgical device

HUANG Huijuan1*， QIAO Yujie2， WU Jianying2**

（1. Shanghai Jianhua Fine Biological Products Co.， Ltd.， Shanghai 200231， China； 2. Shanghai Haohai Biotechnology Co.， Ltd.， Shanghai 200052， China）

ABSTRACT Objective： To establish a method for the determination of chondroitin sulfate content in ophthalmic viscosurgical device and to conduct methodological validation. Methods： The chondroitin sulfate in the sample was precipitated by sodium acetate and cetylpyridinium chloride， and then precipitate was dissolved in sodium chloride solution and the content of chondroitin sulfate was determined by carbazole method. Results： This method had good specificity with a linear range at 30.07-150.34 mg/ml and correlation coefficient （r） 0.999 5. The average recovery of the 9 groups of samples for accuracy test was 101.40% with RSD （n=9） 0.96%. The average value of 12 parts of samples for precision test was 102.1% with RSD （n=12） 1.22%. The ratio of the content determined under the changed condition to the content determined under normal conditions is 99.9% to 101.4% in the durability test. Conclusion： The method established in this study can be used for the determination of chondroitin sulfate content in ophthalmic viscosurgical device since its linearity， accuracy， precision and durability are in line with standards.

KEy WORDS ophthalmic viscosurgical device； chondroitin sulfate； content

白内障是一种常见的眼科疾病，目前无论是发达国家还是发展中国家白内障致盲性均位居首位。在白内障手术中，眼科粘弹剂是常见的手术辅助材料之一，目前国内产品中眼科粘弹剂的主要成分大多为透明质酸钠，属于内聚性粘弹剂[1-3]。虽然内聚性粘弹剂能维持良好的手术空间，但是高黏滞性和强黏弹性对手术操作过程和眼内环境造成影响，易导致角膜内皮细胞的损伤。硫酸软骨素和透明质酸钠混合制备的弥散性眼科粘弹剂则能够很好地贴覆于眼组织表面，从而更好地保护角膜内皮细胞不受损伤[4-5]。透明质酸钠和硫酸软骨素均为酸性黏多糖，结构与理化性质相似，因此当两者共存于制剂中时，其含量测定会相互干扰。《中华人民共和国药典》2015年版二部采用HPLC法测定硫酸软骨素含量，但是由于样品中含有的透明质酸钠是大分子高黏度的化合物，不适合进色谱柱。本研究首先用醋酸钠调节样品的pH，加入适量氯化十六烷基吡啶（CPC）选择性地沉淀硫酸软骨素，而透明质酸钠不被沉淀，从而将两者有效分离，并参考《中华人民共和国医药行业标准YY/T 0308-2015醫用透明质酸钠凝胶》中“透明质酸钠含量测定方法（咔唑法）”测定硫酸软骨素含量，并进行方法学验证。

1 实验材料与方法

1.1 仪器

Evoiution 260Bio紫外可见分光光度计[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]；MS105DU分析天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）；电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）。

1.2 药品与试剂

眼科粘弹剂（含透明质酸钠和硫酸软骨素，上海建华精细生物制品有限公司自制，批号：180523，180530，180610）；硫酸软骨素钠（纯度99.5%，中国食品药品检定研究院，批号：140792-201702）；氯化十六烷基吡啶（化学纯，国药集团化学试剂有限公司）；无水醋酸钠（特优级，上海泰坦科技股份有限公司）；其余测试用试剂均为国产分析纯。

1.3 方法

1.3.1 供试品溶液的制备

取眼科粘弹剂样品适量，精密称定，加蒸馏水稀释至每1 ml溶液中含硫酸软骨素1 mg，即得样品溶液。精密量取样品溶液10 ml置小烧杯中，加入醋酸钠1.6 g，搅拌，使醋酸钠溶解后，精密加入0.8%的氯化十六烷基吡啶溶液10 ml，充分搅拌，静置2 h，用5 μm微孔滤膜通过抽滤滤过，过滤2次，将滤饼置小烧杯内，加1.4 mol/L氯化钠溶液约30 ml，超声处理，将溶液定量转移至100 ml容量瓶中，重复处理3次，稀释至刻度，即得。

1.3.2 标准溶液的制备

取硫酸软骨素对照品适量，精密称定，置量瓶中，加1.4 mol/L氯化钠溶液溶解至刻度，摇匀，制成每1 ml含150 μg硫酸软骨素，即得标准溶液。

1.3.3 测定法

精密量取标准溶液0 ml、0.2 ml、0.4 ml、0.6 ml、0.8 ml、1.0 ml分别置于25 ml具塞试管中，依次分别加1.4 mol/L氯化钠溶液至1.0 ml，混匀置于冰水浴中，分别缓慢加入0.025 mol/L四硼酸钠硫酸溶液5.0 ml，边加边摇匀，密塞，沸水浴加热15 min（中间振摇1次），迅速冷却，加0.125%咔唑-无水乙醇溶液0.2 ml，摇匀，沸水浴加热15 min（中间振摇1次），冷却至室温。以不加标准溶液管为空白对照在530 nm波长处测定吸光度。以标准溶液浓度（μg/ml）为x轴，其相应的吸光度值为y轴作直线回归，求得直线回归方程。精密量取供试品溶液1 ml，置25 ml具塞试管中，自“冰水浴中冷却”起，同法操作。由直线回归方程计算硫酸软骨素的浓度，并按样品标示浓度40 mg/ml计算样品中硫酸软骨素的含量。

2 方法学验证

2.1 线性

按1.3.2项下制备标准溶液，按1.3.3项下求得直线回归方程，得到线性方程为y=0.005 5x+ 0.017，r为0.999 5，符合r≥0.990的要求，线性良好，含量可测定范围为30.07～150.34 μg/ml。

2.2 准确度

取已知含量的硫酸软骨素对照品适量，精密称定，加入按产品处方比例配制不含硫酸软骨素的溶液，使得硫酸软骨素的浓度分别为0.8 mg/ml，1.0 mg/ml和1.2 mg/ml，按1.3.1项中“精密量取样品溶液10 ml置小烧杯中”起同法操作制备供试品溶液，每个浓度平行配制3份，按1.3.3项测定法测定硫酸软骨素的含量，并计算回收率（表1）。

2.3 精密度

两位研究员分别按1.3.1项下同时制备6份供试品溶液，按1.3.3项测定法测定硫酸软骨素的含量，分别计算6组样品检测结果平均值和RSD值，并比较两位研究员的检测结果（表2）。

2.4 耐用性

在其他测定条件不变的情况下，测定方法发生微小变动，考察该方法的耐用性。调整水解时间至方法规定的±2 min，调整最大吸收波长至方法规定的±2 nm，并作隨行线性，测定硫酸软骨素的含量（表3）。改变条件测得的结果与正常条件下测得的含量之比在99.9%～101.4%之间，均符合标准。

2.5 样品含量的检测

采用该方法检测3批自制样品，批号为180523、 180530、180610的眼科粘弹剂硫酸软骨素含量分别为101.6%、102.1%、101.3%。

3 讨论

本研究通过参考文献资料[6-10]，建立了咔唑法检测眼科粘弹剂中硫酸软骨素含量的方法，选用醋酸钠和氯化十六烷基吡啶使硫酸软骨素沉淀，得到的滤饼采用氯化钠溶液完全溶解后进行测定，对照品采用硫酸软骨素标准品。方法学验证结果表明，该方法线性良好，准确度、精密度和耐用性试验结果均符合标准。采用该方法检测3批次自制样品，硫酸软骨素含量均符合标准。本研究试验方法稳定，能准确检测样品中的硫酸软骨素含量，可用于眼科粘弹剂产品硫酸软骨素含量的测定。

参考文献

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