hADRB3重组腺病毒的构建及经心包注射后hADRB3在CHF大鼠体内的表达

宋衍秋,耿 华,刘 珊,薛向阳,毛用敏,徐美林,秦 勤,3,丛洪良,3

(1.天津市心血管病研究所 300222；2.天津市胸科医院病理科 300222；3.天津市胸科医院心内科 300222)

β-肾上腺素受体(β-adrenergic receptors，β-ARs)是交感神经系统的重要成员，1983年TAN等[1]首次发现除了传统的β1/β2-AR之外，人类还存在另一种β-AR，即β3-AR，β1-AR、β2-AR与β3-AR都属于G蛋白偶联受体家族成员，三者氨基酸序列有40%～50%的同源性[2]。人类心房和心室均已发现β3-AR的表达，不同于β1/β2-AR在心脏产生的正性肌力作用，β3-AR激动剂表现为负性肌力作用[3]，提示β3-AR可能在心力衰竭的发生、发展过程中发挥一定的作用。有研究发现，β3-AR激动剂较对照组可以明显提高胸主动脉缩窄心力衰竭小鼠左心室短轴缩短指数，降低左心室舒张末径，具有心脏保护作用[4]。β3-AR有望成为治疗心力衰竭的新靶点。然而目前β3-AR与β1/β2-AR氨基酸序列激动剂同源性较高，因此其激动剂特异选择性不高，往往兼具β1/β2-AR激动作用，具有心动过速等不良反应。本研究旨在构建携带人β3-AR基因(hADRB3)高滴度纯化重组腺病毒Ad-hADRB3，并观察经心包注射后hADRB3在慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)大鼠体内的表达情况，为进一步研究β3-AR在心力衰竭中的作用及具体机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1动物 清洁级Wistar雄性大鼠20只，8周龄，体质量250～300 g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供。

1.1.2质粒、菌种和细胞系 AdEasy-1缺陷性腺病毒载体系统：穿梭质粒pAdTrack-CMV、骨架质粒pAdEasy-1购自武汉淼灵生物科技有限公司；hADRB3 cDNA购自质粒R&D Systems公司；E.coil DH5α、E.coil BJ5183购自天津心血管病研究所；AD293细胞购自天津心血管病研究所。

1.1.3主要试剂及仪器 限制性内切酶HindⅢ、SalⅠ、BamHⅠ、PacⅠ、PmeⅠ购自美国Thermo公司，Plasmid Midi Kit购自德国Qiagen公司，LipofectamineTMLTX Reagent购自美国Invitrogen公司，达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)、胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公司，0.25%Trypsin-乙二胺四乙酸(EDTA)、Penicilin-streptomycin购自美国Thermo公司，ViraBindTMAdenovirus Miniprep Kit购自美国Cell Biolabs公司，病毒裂解液[0.10%十二烷基硫酸钠(SDS)、10 mmol/L Tris-HCl pH 7.4、1 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)]、琼脂糖购自美国Prom ega公司，hADRB3 polyclonal antibody购自美国Abnova公司。Multiporator电穿孔仪、舒适型恒温混匀器台、Centrifuge 5415D小型高速离心机、Centrifuge 5417R台式高速冷冻离心机均购自德国Eppendorf公司，电泳仪购自北京六一生物科技有限公司，倒置荧光显微镜购自日本Nikon公司，二氧化碳细胞培养箱购自美国Thermo公司，高速冷冻离心机购自美国Beckman公司。

1.2方法

1.2.1pAdTrack-hADRB3重组质粒的构建与鉴定 HindⅢ、SalⅠ双酶切hADRB3 cDNA质粒，1%琼脂糖凝胶平板电泳法检测双酶切产物，电洗脱回收hADRB3 cDNA片段。HindⅢ、SalⅠ双酶切质粒pAdTrack-CMV。电洗脱法回收pAdTrack-CMV HindⅢ、SalⅠ双酶切线性片段。T4 DNA Ligase连接hADRB3 cDNA片段与pAdTrack-CMV HindⅢ、SalⅠ双酶切线性片段，连接产物转化E.coliDH5α感受态细胞，经Kan+LB培养基培养，碱裂解法小量提取重组质粒，HindⅢ、SalⅠ双酶切鉴定重组质粒。碱性裂解法获取重组完全正确的pAdTrack-hADRB3重组质粒。

1.2.2pAdEasy-hADRB3重组质粒的构建与鉴定 pAdTrack-hADRB3重组质粒经PemⅠ酶切，电洗脱回收线性片段， pAdTrack-hADRB3 PemI酶切线性片段电转法转入含pAdEasy-1的E.coliBJ5183电感受态细胞，转化产物经Kan+LB固体培养基培养，碱性裂解法提取pAdEasy-hADRB3重组质粒，分别行BamHⅠ、PacⅠ酶切鉴定，并对pAdEasy-hADRB3重组质粒行目的基因序列测定(Invitrogen)。应用Plasmid Midi Kit提取重组正确的pAdEasy-hADRB3重组质粒。

1.2.3重组腺病毒Ad-hADRB3的包装与扩增

1.2.3.1重组腺病毒Ad-hADRB3的包装 PacⅠ酶切pAdeasy-hADRB3使其线性化。转染前1 d，AD293细胞种植于60 mm培养皿。转染时细胞密度40%左右。5 μg PacⅠ线性化重组质粒pAdeasy-hADRB3片段转染AD293细胞，常规培养7～10 d，每天观察细胞生长及细胞中绿色荧光蛋白(GFP)出现的情况。当GFP表达呈“彗星”状，并出现细胞病变效应(CPE)时，收集细胞于15 mL离心管中，经-80 ℃冷冻、37 ℃融化-涡旋震荡，反复4次，使细胞裂解。离心12 000 r/min×3 min，病毒上清液分装至1.50 mL离心管中，-80 ℃保存备用。

1.2.3.2重组腺病毒Ad-hADRB3的扩增 感染前1 d，AD293细胞植于100 mm培养皿，感染时细胞密度80%左右。将200 μL Ad-hADRB3病毒液加至1.5 mL DMEM完全培养液中，常规培养90 min后，加入3.50 mL DMEM完全培养液，常规培养。感染第3天，细胞出现明显CPE并伴有脱落，收集病毒。重复100 mm培养皿感染3次，第4次在2个75 cm2培养瓶中进行。

1.2.3.3重组腺病毒Ad-hADRB3的纯化及滴度测定 应用ViraBindTMAdenovirus Miniprep Kit纯化重组腺病毒Ad-hADRB3，严格按照试剂盒说明书操作。无菌超净台内用病毒裂解液稀释Ad-hADRB3病毒液，稀释度为1∶10、1∶25、1∶50，测定病毒稀释液的OD260，1∶50测定2次，1∶25和1∶10测定1次，取4次测量结果的平均值作为最终结果。病毒滴度(V.P/mL)=OD260×病毒稀释度×测定稀释度×1.10×1012。

1.2.4重组腺病毒Ad-hADRB3的功能鉴定

1.2.4.1构建CHF大鼠模型及分组、给药方法 腹主动脉缩窄法构建CHF大鼠模型，用于后续实验。CHF成模大鼠10只，将其分为观察组和对照组，每组5只，观察组心包注射2.50×1011VP/mL NS重组腺病毒Ad-hADRB3 100 μL，对照组予以心包注射0.90% NaCl 100 μL；给予重组腺病毒Ad-hADRB3第7天后处死两组动物。

1.2.4.2免疫组织化学(IHC)检测hADRB3在CHF大鼠多脏器中的表达 两组大鼠处死后，在心、肝、脾、肺、肾及小肠取材后，经固定、包埋、切片，IHC染色，hADRB3抗体稀释度为1∶50，二氨基联苯胺(DAB)法显色。

2 结 果

2.1重组质粒pAdTrack-hADRB3的鉴定 经HindⅢ、SalⅠ双酶切后pAdTrack-hADRB3可产生1 285 bp片段。2%琼脂糖凝胶电泳鉴定结果，见图1。

1～10：pAdTrack-hADRB3双酶切；M：DL Marker

图1重组质粒pAdTrack-hADRB3 HindⅢ、SalⅠ双酶切鉴定电泳图

2.2重组质粒pAdEasy-hADRB3的鉴定

2.2.1BamHⅠ酶切鉴定pAdEasy-hADRB3重组质粒 由于pAdEasy-1质粒含有2个BamHⅠ酶切位点，pAdTrack-CMV和获得的hADRB3目的基因片段中各含有1个BamHⅠ酶切位点，酶切后可产生3个片段(21.0、11.7、5.2 kb)。2%琼脂糖凝胶电泳鉴定结果，见图2。

1：pAdTrack-CMV BamHⅠ酶切;2：pAdEasy-1 BamHⅠ酶切;3：pAdEasy-hADRB3 BamHⅠ酶切；M：DL Marker

图2重组质粒pAdEasy-hADRB3 BamHⅠ酶切鉴定电泳图

2.2.2PacⅠ酶切鉴定pAdEasy-hADRB3重组质粒 穿梭质粒pAdTrack-CMV上有2个PacⅠ酶切位点，骨架质粒pAdEasy-1上有1个PacⅠ酶切位点，同源重组成功经PacⅠ酶切产生了1个较大片段和1个4.5 kb左右片段。2%琼脂糖凝胶电泳鉴定结果，见图3。

1、2：pAdEasy-hADRB3 PacⅠ酶切;3：pAdEasy-1 PacⅠ酶切;4：pAdTrack-CMV PacⅠ酶切;M：DL Marker

图3重组质粒pAdEasy-hADRB3 PacⅠ酶切鉴定电泳图

2.2.3测序鉴定 DNA测序证实pAdEasy-hADRB3重组质粒中目的基因hADRB3未出现碱基的突变、错配等异常，与Homo sapiens adrenoceptor beta 3 (ADRB3),mRNA(NM_000025.2)CDS基因序列完全一致。

2.3重组腺病毒Ad-hADRB3在AD293细胞中的包装与扩增

2.3.1pAdEasy-hADRB3 PacⅠ酶切线性片段转染AD293细胞 转染后第2天倒置荧光显微镜下即可见散在GFP；转染后第7天，GFP呈“彗星”状改变(图4A)；转染后第9天AD293细胞出现明显的CPE，见图4B。

A：转染后第7天(×40)；B：转染后第9天(×200)

图4 GFP跟踪重组腺病毒Ad-hADRB3包装过程

2.3.2重组腺病毒Ad-hADRB3感染AD293细胞 首次感染后第2天即可见GFP呈散在荧光分布；感染后第3天即出现明显CPE，细胞呈“葡萄”串状改变。重复感染时，感染后第2天即可见GFP高强度表达(图5A)；感染后第3天CPE明显，大部分细胞脱落，见图5B。

A：感染后第2天GFP表达；B：感染后第3天细胞形态

图5重组腺病毒Ad-hADRB3感染AD293细胞(×200)

A:心肌细胞(×200);B：肺血管内皮细胞(×100)；C：肝细胞(×100)；D：脾细胞(×100)；E：肾小球毛细血管内皮细胞(×200)；F：肠黏膜上皮细胞(×200)

图6 CHF大鼠多脏器hADRB3表达IHC染色

2.3.3重组腺病毒Ad-hADRB3滴度测定 分光光度计测定Ad-hADRB3病毒滴度为5.20 ×1012VP/mL。

2.4重组腺病毒Ad-hADRB3的功能鉴定 经心包注射方式给予重组腺病毒Ad-hADRB3感染CHF大鼠，CHF大鼠心、肺、肝、脾、肾及小肠多器官组织切片IHC染色均检测出hADRB3的表达。在CHF大鼠的心肌细胞、肺细小支气管上皮及肺血管内皮细胞、肝细胞、脾细胞、肾小球毛细血管内皮细胞及肠黏膜上皮细胞细胞质内均可见hADRB3阳性颗粒，见图6。

3 讨 论

心力衰竭是各种心脏病的终末阶段，是威胁全球性公众健康的主要原因，不仅病死率高、预后差，其医疗支出已经成为国家和国民巨大的经济负担。随着冠心病、高血压、糖尿病等疾病发病率的上升，心力衰竭已经成为全球亟待解决的公共卫生问题[5]。传统药物治疗，虽能有效缓解心力衰竭的症状，降低患者住院率，但其5年病死率仍超过50%[6]，仍未达到理想的治疗效果。因此，进一步探寻心力衰竭的发病机制及防治措施是当今心血管领域的热点。β3-AR是β-ARs的1个亚型，属于G蛋白偶联受体家族。β3-AR在机体广泛分布，如白色脂肪组织、棕色脂肪组织、骨骼肌、肠道平滑肌、呼吸系统等，主要参与机体的代谢，介导白色脂肪组织的脂肪分解和棕色脂肪组织的产热作用及胃肠道活动等[7]。有研究在人类和动物模型中均证实衰竭心脏较非衰竭心脏β3-AR表达升高2～3倍，负性肌力作用持续增强，提示β3-AR可能在心力衰竭的发生、发展过程中发挥一定的作用[8-9]。最新的一项关于β3-AR激动剂对CHF患者作用的临床试验结果表明，给药6个月，米拉贝隆(β3-AR激动剂)较安慰剂对心肌梗死后心力衰竭患者左心室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)无明显影响，不良事件发生率也相似，但探索性分析显示对于LVEF<40%的患者米拉贝隆可改善患者LVEF[10-11]。提示β3-AR激动剂可能成为治疗心力衰竭的一个新方向，但同样不能忽视米拉贝隆兼具部分β1/β2-AR激动作用。可见一种高效高选择性β3-AR激动剂对于探索β3-AR在心力衰竭中的作用及机制至关重要。

将外源性基因转移到细胞或组织稳定表达，合适的载体是关键因素之一，常用的载体有病毒载体和非病毒载体。病毒载体主要包括反转录病毒载体、腺病毒相关病毒载体、腺病毒载体等[12]。腺病毒作为传输载体具有许多优点：(1)宿主范围广，对人致病性低。腺病毒可以感染一系列哺乳动物细胞，因此在大多哺乳动物细胞和组织中均可用来表达重组蛋白。(2)可以感染增殖和非增殖细胞，对于心肌细胞、神经细胞等终末细胞而言，腺病毒载体是最佳的外源性基因表达系统。(3)外源性基因容量大，可插入8 kb外源基因，潜在容量可达30 kb。(4)不整合至宿主细胞基因组，无插入致突变性。(5)不需要辅助病毒，能有效地进行增殖，易于培养和纯化，病毒滴度可高达1012pfu/mL，适于进行基因治疗[13]。由于hADRB3片段较大，因此本实验选用腺病毒载体系统，构建Ad-hADRB3。

本研究应用AdEasy-1腺病毒系统采用两步转化法[14]构建重组腺病毒。第一步先将pAdEsay-1骨架质粒转化进入大肠埃希菌BJ5183，制备含有pAdEsay-1骨架质粒的大肠埃希菌BJ5183感受态细菌；第二步，将pAdTrack-CMV-hADRB3 PmeⅠ酶切线性片段电转化转入大肠埃希菌BJ5183感受态细菌，进而与其内部的pAdEsay-1骨架质粒进行同源重组。该方法明显提高了同源重组的成功率，缩短了实验周期，得到广泛应用[15]。

目前尚鲜见应用腺病毒载体系统构建携带hADRB3基因重组腺病毒相关报道。本研究发现，应用AdEasy-1缺陷性腺病毒载体系统，能够成功构建重组腺病毒Ad-hADRB3，获得的纯化重组腺病毒Ad-hADRB3经心包注射的方式可以有效感染CHF大鼠，hADRB3可以在CHF大鼠心、肺、肝、脾、肾及小肠多器官组织中表达，证实以腺病毒为载体介导的外源hADRB3基因可在CHF大鼠体内有效表达，可为进一步研究人β3-AR在心力衰竭中的作用及具体机制，提供高效、高选择特异性的实验工具。