1例马凡综合征患者原纤维蛋白1基因突变分析

倪二茹，肖晶晶，吴少鸿，李欣，谢华斌，姜萍萍

(1厦门大学附属心血管病医院，福建厦门361004；2厦门大学医学院；3深圳美因医学检验实验室)

马凡综合征(MFS)是一种常染色体显性遗传性结缔组织疾病[1]，它的发生与多种基因的突变密切相关[2]，主要是人原纤维蛋白1基因(FBN1)[3]和转化生长因子β受体(TGFBR)基因[4]。其中，以FBN1基因突变与马凡综合征相关性的研究最多[5]。FBN1基因突变的类型多样，新的突变位点仍不断被发现，目前已报道的FBN1突变超过1 800种[6]。FBN1基因突变的类型和位点与临床表型有直接的关系，通过基因测序的方法分析FBN1基因的突变情况，有助于马凡综合征的分子诊断和家系遗传分析，同时可以研究FBN1基因突变与临床表型之间的关系[7, 8]。2018年11月，我们对1例临床确诊马凡综合征患者的FBN1基因进行检测和分析，在分子水平上探讨该患者致病的可能原因。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择同期厦门大学附属心血管病医院收治的1例患有马凡综合征的先证者及其所有家系成员。先证者男性，18岁，于12岁时体检发现心脏杂音，无明显不适，身高体长且明显高于同龄人，胸部外凸畸形，CT检查发现主动脉根部增宽，心脏超声提示二尖瓣、三尖瓣脱垂并关闭不全(见图1)，临床诊断为马凡综合征，未予特殊处理。后患者定期复查，瓣膜反流逐渐加重。14岁时先证者心脏超声检查示左心室内径(LVD)63 mm，左心室射血分数(EF)70%，二尖瓣叶脱垂合并重度关闭不全，三尖瓣叶脱垂合并轻度关闭不全。后先证者于14岁时接受全麻下二尖瓣替换手术，术中探查见二尖瓣瓣叶增厚，键索纤细延长，二尖瓣瓣叶脱垂，瓣环扩张，瓣口对合不严。术中进行了双叶机械瓣间断缝合，完成二尖瓣置换术。测试瓣膜启闭良好。术后患者恢复良好，复查未见异常。本研究符合赫尔辛基宣言，并得到了厦门大学附属心血管病医院伦理委员会的批准。先证者及其所有家系成员均签署了知情同意书。先证者及其所有家系成员的个人信息均得到严格的保密。

1.2 家系情况 该先证者家系成员2代共3人，其中患病者1例(即先证者，男性)，见图2。先证者的父母无马凡综合征的临床症状，先证者无兄弟姐妹，父母双方无相关症状的亲属。

1.3 基因组DNA提取 经先证者及其所有家系成员同意，取先证者及其父母外周静脉血4 mL，利用全血基因组提取试剂盒(HiPure Tissue & Blood DNA Kit，美基生物)提取基因组DNA，并测定浓度。

1.4 目标区域捕获测序 采用目标区域捕获测序技术对先证者进行基因检测。具体步骤如下：采用Agilent定制化探针试剂盒(瑞士Roche公司)建立含目标基因的全基因文库，包括已知的13种遗传性心源性猝死相关疾病的88个基因，其中包括马凡综合征相关基因(FBN1、TGFBR1和TGFBR2)。采用Illumina HiSeq2500测序仪(美国Illumina公司)进行高通量测序。

注：左上为CT示主动脉根部宽度为4.46 cm；右上为心脏彩超示三尖瓣反流；左下为心脏彩超示二尖瓣反流；右下为心脏彩超示二尖瓣脱垂。

图1 先证者心脏超声表现

注：Ⅰ:1、Ⅰ:2分别为先证者的父母；Ⅱ:1为先证者。

图2 先证者的家系图

1.5 生物信息学分析 对上述测序获得的原始数据采用BWA软件(http://biobwa.sourceforge.net)与hg19人基因组数据库(http://hgdownload.cse.ucsc.edu/)进行比对，之后使用GATK软件(https://software.broadinstitute.org/gatk/)进行变异分析，变异位点经深圳美因临床检验实验室自研的软件进行注释。变异注释工作包括：识别单核苷酸变异(SNV)、插入和缺失变异(INDEL)是否引起蛋白质编码或者是氨基酸改变，识别变异是否在保守区域；识别变异在人群数据库中的频率，数据库包括国际千人基因组计划t(http://browser.1000genomes.org/)、美国国家心肺和血液研究所外显子组测序计划(https://evs.gs.washington.edu/EVS/)、外显子组整合联合数据库(ExAC，http://exac.broadinstitute.org/)和Dbsnp数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)等；计算突变有害性分数；查找变异与疾病之间的关系，用到的数据库包括HGMD(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)、OMIM(https://omim.org/)、NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和CGD(http://www.candidagenome.org/)。对数据库中的纯合变异以及最小等位基因频率(MAF)大于0.01进行过滤，进一步筛选先证者样本中的DNA变异。

1.6 位点解读 数据解读规则参考美国医学遗传学和基因组学学院(ACMG)相关指南。

1.7 Sanger测序 经目标区域捕获测序筛选的候选变异位点采用Sanger测序进行验证，同时在先证者父母中进一步验证。具体操作步骤如下：聚合酶链反应(PCR)，反应条件为94 ℃预变性3 min；94 ℃ 30 s、56 ℃ 45 s、72 ℃ 60 s，30个循环，72 ℃延伸5 min；将PCR产物送至赛默飞世尔科技(中国)有限公司进行Sanger测序。

1.8 蛋白结构分析 将突变后的DNA序列进行氨基酸序列预测，之后使用SWISS-MODEL找到与目标序列一致度≥30%的已知结构作为模板。

2 结果

2.1 目标区域捕获测序 经目标区域捕获测序，共产出773.80 Mb数据，比对率达99.83%，目标区域平均测序深度为523.53x，覆盖度为99.90%。其中FBN1 TGFBR1和TGFBR2基因的测序深度分别达542x、516x、593x，覆盖度均为100%。共检测出单核苷酸变异位点(包括错义突变和同义突变)124个；插入和缺失变异2个。通过对公共数据库过滤，频率小于0.01的罕见突变有3个。

2.2 生物信息学分析 生物信息学技术分析发现先证者携带FBN1基因c.2023_2026delTTTG突变。转录本NM_000138.4，氨基酸变异p.F675Vfs*42，杂合突变，未在千人基因组数据库及EXAC数据库中发现突变频率。该突变位于17号外显子区，属于移码突变，导致了675位的苯丙氨酸变成了缬氨酸，并产生新的阅读框架，终止于第675位密码子下游42位密码子处，因此会生成一个缩短并变异的RNA以及蛋白。

2.3 Sanger测序 采用Sanger测序对FBN1基因移码突变的先证者及其父母进行验证，结果显示，先证者为FBN1(c.2023_2026delTTTG,p.F675Vfs*42)的杂合移码突变，与目标区域捕获测序发现的FBN1基因突变一致，而其父母不具有该突变，因此该突变为新生突变(denovo突变)。见图3。

2.4 蛋白结构分析 建立FBN1基因p.F675Vfs*42突变翻译的异常蛋白3D构象后，显示移码突变导致了675位的苯丙氨酸变成了缬氨酸，并产生新的阅读框架，终止于第675位密码子下游42位密码子处。FBN1编码的正常的FBN1前体由2871个氨基酸组成，而p.F675Vfs*42突变编码的只有716个氨基酸，缺失了大部分的原FBN1正常结构，彻底改变了蛋白质的构象，损坏了蛋白质的功能，不能转化成正常的FBN1。

注：A为患者Sanger测序结果，存在c.2023_2026delTTTG突变，杂合缺失；B为患者父亲Sanger测序结果，无突变；C为患者母亲Sanger测序结果，无突变。

图3 先证者及其父母FBN1基因的Sanger测序峰图

3 讨论

马凡综合征是一种常染色体显性遗传的疾病，常表现为蜘蛛指(趾)病、细长肢体病、长肢病、指(趾)过长综合征、长瘦、抑郁症、蜘蛛手合并晶状体脱位等[1]。在遗传学上，马凡综合征具有外显率高、表现度不一等特点，故临床表现多种多样[9, 10]，主要变现为骨损坏、眼损害及心血管病变三联征。该病属于结缔组织遗传缺陷疾病，其病变可累及全身各个系统，而严重的心血管并发症是患者的主要致死因素[11]。根据修订版Ghent诊断方案[12]，若患者无马凡综合征家族史，但主动脉根部直径Z值≥2，合并晶状体脱位、FBN1基因突变，系统评分>7分，三者之一；或晶状体脱位合并FBN1基因突变并主动脉病变，马凡综合征诊断成立。本文先证者临床症状表现胸廓畸形、臂展和身高均过大，心脏彩超检查示主动脉根部增宽，二尖瓣、三尖瓣脱垂并关闭不全，具有典型的马凡综合征的临床表现。

FBN基因家族和TGFBR基因家族是马凡综合征的主要致病原因。FBN基因家族中FBN1基因编码的人FBN1位于15号染色体的长臂(15q15～q21.1)，包含65个外显子，将近10 000个核苷酸，编码的蛋白质相对分子量约为350 kDa。该蛋白含有47个表皮生长因子样结构域，7个8-半胱氨酸结构域，2个杂交结构域和1个富脯氨基酸结构域。FBN1蛋白与其他细胞外基质形成弹性纤维，维持组织的弹性。本文在对先证者的基因组DNA进行目标区域捕获测序后，分析了马凡综合征相关的FBN1、TGFBR1和TGFBR2基因的突变情况。经过生物信息学技术的分析，发现先证者携带了FBN1基因c.2023_2026delTTTG突变。该突变位于17号外显子区，由于移码突变，导致了675位的苯丙氨酸变成了缬氨酸，并产生新的阅读框架，终止于第675位密码子下游42位密码子处，因此会生成一个缩短并变异的RNA以及蛋白。进一步的蛋白结构分析发现正常FBN1基因编码的FBN1蛋白有2 871个氨基酸，而FBN1基因c.2023_2026delTTTG突变编码的FBN1蛋白只有716个氨基酸，缺失了大部分的FBN1蛋白的正常结构，彻底改变了蛋白质的构象，损坏了蛋白质的功能，不能转化成正常的FBN1蛋白。根据ACMG评估指南，定义该位点为疑似致病突变的变异，而GeneDx基因检测公司认为该位点为致病突变。Howarth等[13]在2007年首次报道了该突变，其在两个非亲属关系的马凡综合征的患者中检测到了该突变；并且在家系验证中，10个未患病人员未检测到该突变，而在5例患病人员中均检测到了该突变；且未在各大数据库中报道。除此之外，FBN1基因c.2023_2026delTTTG突变尚未在其他文献中报道过。

本文的先证者父母没有携带相同的突变，而先证者没有兄弟姐妹，故无法对该基因型与临床表型的关系进行验证。虽然没有该位点与马凡综合征的表型关联的文献研究报道，但是在与马凡综合征相关的FBN1基因突变中，提早终止密码突变(PTC)以及移码突变是FBN1突变中的最主要的两种类型[14]，PTC突变与严重的骨骼和皮肤表型相关[15]，很少出现眼部的病变。

综上所述，本文通过对1例临床确诊马凡综合征的先证者及其父母进行FBN1基因的检测，发现先证者携带的FBN1基因c.2023_2026delTTTG突变会产生一个截短的FBN1蛋白，可能是马凡综合征的一个致病突变。