稳定干扰Drp1基因的慢病毒载体质粒及神经母细胞瘤细胞株构建

周梦琪，柴原，冯琬迪，马浩洁，盖聪，孙红梅

(北京中医药大学中医学院，北京102488)

帕金森病(PD)是一种发病率较高的神经退行性疾病，与环境毒素和遗传缺陷造成线粒体的异常及线粒体分裂融合的动态平衡被破坏密切相关[1,2]。线粒体的分裂主要由Drp1基因来调控，且分裂的频率决定了线粒体的形态和功能。因此，Drp1基因与PD的关系越来越被关注和重视。2017年6月8日～2017年7月23日，本研究构建了稳定干扰Drp1基因的重组慢病毒载体质粒Drp1-RNAi，包装病毒后感染并筛选稳定干扰Drp1基因的神经母细胞瘤细胞株，为进一步研究Drp1基因在PD发病过程中的作用提供了细胞模型。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器 人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y、GV248慢病毒骨架质粒hU6-MCS-CMV-EGFP、大肠杆菌TOP10感受态细胞、293T细胞、慢病毒包装辅助质粒pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体、嘌呤霉素(REVG1001)、聚凝胺(REVG0001)助感染试剂和Enhanced Infection Solution(REVG0002)感染用培养基均购自上海吉凯基因技术有限公司，T4 DNA连接酶和逆转录试剂盒购自美国Thermo Scientific公司，限制性核酸内切酶购自上海NEB公司，Taq Plus DNA polymerase购自南京Vazyme公司，Lipofectamine 3000转染试剂、TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司，无内毒素质粒大提试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，THUNDERBIRD qPCR定量检测试剂购自日本TOYOBO公司，二氧化碳培养箱购自日本SANYO公司，高速冷冻离心机购自美国Thermo Scientific公司，倒置式荧光显微镜购自日本Nikon TE2000公司，超净工作台购自北京昌平长城空气净化工程公司，激光共聚焦扫描显微镜购自日本Olympus FV1000公司，Safire2全波长荧光酶标仪购自瑞士TEcan公司，PCR仪购自美国ABI公司，测序仪购自美季生物公司，数显式稳压稳流电泳仪、凝胶成像仪购自天能公司，CytoFLEX流式细胞仪购自美国贝克曼库尔特有限公司，细菌摇床购自华利达实验设备公司，Blue Pard隔水式恒温培养箱购自上海一恒科学仪器有限公司，紫外分光光度仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2 嘌呤霉素的细胞最低致死浓度筛选 取状态良好且处于对数生长期的SH-SY5Y细胞接种于96孔板中培养24 h，设置实验组、对照组。实验组中分别加入1、2.5、5、7.5、10 μg/mL浓度的嘌呤霉素工作液，每个浓度设置5个复孔；对照组不加嘌呤霉素工作液。以不含SH-SY5Y细胞的孔为空白组，采用CCK-8法测算各组细胞存活率，结果显示，随着嘌呤霉素浓度增加，实验组细胞存活率逐渐降低，但当嘌呤霉素浓度为5、7.5、10 μg/mL时，实验组细胞存活率均小于30%，且三组间细胞存活率相比，P均>0.05，故选取浓度最低的5 μg/mL为嘌呤霉素最低致死浓度进行后续实验。

1.3 重组慢病毒载体质粒Drp1-RNAi的构建与鉴定 于Gen Bank中检索人Drp1基因的核苷酸序列(基因编号10059 DNM1L)，利用BLOCK-iTTM RNAi Designer公用设计软件(http://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/insert.do)设计并筛选最佳动力学参数的干扰序列为：5′-GTGGTGCTAGAATTTGTTA-3′，同时设计作为阴性对照的无关序列为：5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′，根据靶序列分别设计并合成干扰RNA(siRNA)的单链DNA寡核苷酸(DNA oligo)。把合成的单链DNA oligo干粉与退火缓冲液配制成终浓度为20 μmol/L 的溶液，90 ℃水浴15 min，自然冷却至室温，退火后形成带黏性末端的双链DNA oligo片段。分别用AgeⅠ与EcoRⅠ双酶切双链DNA oligo片段和GV248慢病毒骨架质粒hU6-MCS-CMV-EGFP后，加入T4 DNA连接酶4 ℃连接过夜，得到重组慢病毒载体质粒Drp1-RNAi和阴性对照质粒。将10 μL重组慢病毒载体质粒Drp1-RNAi加入到100 μL大肠杆菌TOP10感受态细胞中,冰上反应30 min，42 ℃热激90 s，冰水培养2 min。取适量菌液均匀涂布在含有氨苄霉素的平板上，在恒温培养箱中倒置培养12～16 h，挑选单个菌落分别接种于LB液体培养基中，置于37 ℃摇床上振荡培养16 h，按照无内毒素质粒大提试剂盒说明书分别提取质粒DNA，用测序仪对其进行DNA测序，将DNA测序结果与设计的干扰序列进行对比，进一步确定插入序列的正确性。

1.4 稳定干扰Drp1基因的神经母细胞瘤细胞株的建立及鉴定 取对数生长期293T细胞于细胞培养皿中重悬，待细胞汇合度70%～80%时，用Lipofectamine 3000将重组慢病毒载体质粒Drp1-RNAi和辅助质粒(pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体)转染至293T细胞中，培养48 h后收集上清液，离心后过滤得到Drp1-RNAi重组慢病毒和阴性对照慢病毒，分装后储存于-80 ℃冰箱内备用。取对数生长期SH-SY5Y细胞，以5×104/mL接种于6孔板中，分为Drp1-RNAi重组慢病毒组(D组)、阴性对照组(N组)、正常对照组(C组)。D组、N组分别加入Drp1-RNAi重组慢病毒、阴性对照慢病毒和含10 μg聚凝胺助感染试剂的细胞增强液，培养24 h后更换为含10%胎牛血清的DMEM培养基继续培养48 h，再用含5 μg/mL嘌呤霉素的完全培养基进行筛选，每隔2～3 d换液、传代，反复筛选2周，荧光显微镜下观察，带有绿色荧光的细胞即为稳定转染的细胞株。C组细胞使用普通培养基正常培养。①采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞Drp1 mRNA。收集各组细胞，采用TRIzol法提取各组细胞总RNA，按照逆转录试剂盒说明书将其逆转录成cDNA，以β-actin为内参，进行实时荧光定量PCR反应。引物序列如下:Drp1上游引物为5′-GGTGAAGCGGCAAATCAAACG-3′，下游引物为5′-ATGTTTTGTGTTGATATAAGCCA-3′；β-actin上游引物为5′-CGGCTACAGCTTCACCACCA-3′，下游引物为5′-CGGGCAGCTCGTAGCTCTTC-3′。建立20 μL PCR反应体系:cDNA 2 μL、power 10 μL、H2O27.2 μL、上下游引物各0.4 μL。PCR反应条件为:95 ℃预变性10 min，40 个循环(95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s、95 ℃ 15 s)。以2-ΔΔCt表示Drp1 mRNA的相对表达量。②采用Western blotting法检测各组细胞Drp1蛋白。收集各组细胞，使用RIPA裂解液提取各组细胞总蛋白，用BCA试剂盒进行蛋白浓度测定后进行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜后封闭1 h，加入相应的一抗，常温在摇床上孵育1 h后4 ℃过夜，次日用TBST洗膜3遍，每次15 min，随后加入相应的二抗孵育1 h，加入ECL化学发光液后采用凝胶成像系统显像，使用Image J软件分析条带灰度值，计算Drp1蛋白的相对表达量。Drp1蛋白的相对表达量=Drp1蛋白条带灰度值/β-actin条带灰度值。

2 结果

2.1 重组慢病毒载体质粒Drp1-RNAi的鉴定结果 DNA测序结果显示，重组慢病毒载体质粒Drp1-RNAi的DNA序列与设计的干扰序列完全一致，见图1，提示重组慢病毒载体质粒Drp1-RNAi构建成功。构建的重组慢病毒载体质粒Drp1-RNAi结构见图2。

注：两个箭头之间即为重组慢病毒载体质粒Drp1-RNAi的DNA序列。

图1 重组慢病毒载体质粒Drp1-RNAi测序结果

2.2 稳定干扰Drp1基因的神经母细胞瘤细胞株的鉴定结果 D组Drp1 mRNA和蛋白的相对表达量为0.47±0.12和0.40±0.04，N组Drp1 mRNA和蛋白的相对表达量为1.12±0.33和0.67±0.05，C组Drp1 mRNA和蛋白的相对表达量为1.02±0.23和0.72±0.02；D组Drp1 mRNA和蛋白的相对表达量与N组、C组相比，P均<0.05；N组Drp1 mRNA和蛋白的相对表达量与C组相比，P均>0.05。

图2 重组慢病毒载体质粒Drp1-RNAi结构图

3 讨论

PD近年的发病率明显上升，调查显示65岁以上人口PD患病率约为1.5%，给社会和经济发展带来沉重的负担[3]。研究[4]表明，线粒体分裂和融合的动态平衡被破坏与PD的发病密切相关。线粒体分裂和融合蛋白大多属于高度保守的三磷酸鸟苷(GTP)蛋白家族，Drp1是其中调控线粒体分裂的关键分子，主要位于细胞浆。在线粒体分裂时，Drp1可被招募到线粒体外膜，富集于线粒体潜在分裂位点，通过GTP水解致线粒体分裂[5]。研究[6]发现，中脑多巴胺神经元被敲除Drp1基因的小鼠可出现PD样运动障碍，纹状体内多巴胺样神经终末和多巴胺的含量明显减少，其多巴胺神经元内的线粒体明显变长、运动变慢，轴突终末内线粒体匮乏。研究[7]发现，果蝇中Drp1基因缺失可以引起线粒体的损伤，导致神经肌肉接头突触传递的障碍，同样线粒体的损耗影响了ATP生产，神经肌肉接头处突触传递的能量供应不足。总之，Drp1介导的线粒体断裂与PD发病有着密切联系。对Drp1的进一步研究，尤其是对它的作用方式和功能的研究，有助于阐明PD的发病机制，也为临床治疗新靶点的发现提供实验依据。

RNA干扰(RNAi)技术是通过双链RNA高效特异地降解同源基因mRNA，从而抑制细胞内特定基因表达的一种基因沉默技术[8]。目前国内外用于沉默基因表达的RNAi载体种类主要有质粒、腺病毒和慢病毒等，每种载体各有特点。质粒载体的速度快，流程相对简单，但其转染效率较低，约为37%左右，且多为瞬时转染[9]；腺病毒载体包装容量大，对人致病性低，能够在增殖和非增殖细胞中感染和表达，但其携带的外源基因不易整合到宿主细胞体中，故不能达到持久抑制靶基因表达的效果[10]；慢病毒载体是以人类免疫缺陷型病毒为基础发展起来的基因载体，与一般的逆转录病毒载体相比，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，并可有效地将外源基因整合至宿主染色体上，从而达到持久性表达，具有感染谱广、感染效率高及稳定表达的优势[11,12]。本研究选取慢病毒构建了靶向干扰Drp1基因的慢病毒载体，并成功转染SH-SY5Y细胞。本研究中，嘌呤霉素最低致死浓度筛选、慢病毒载体质粒的构建及测定，为后期获得稳定干扰Drp1基因的SH-SY5Y细胞模型奠定了基础，之后进一步采用实时荧光定量PCR和Western blotting检测Drp1 mRNA和蛋白的相对表达量，结果提示Drp1的表达被有效抑制，这为进一步了解Drp1与PD的关系奠定了基础。

综上所述，为了探究Drp1与PD发病之间的关系，本研究通过构建Drp1基因的siRNA慢病毒载体，建立稳定干扰Drp1基因表达的SH-SY5Y细胞模型，为进一步研究Drp1基因在PD发病过程中的作用环节和机制奠定了模型基础。