妇科再造丸含药血清对子宫肌瘤细胞增殖和凋亡的影响*

胡颖， 张晴， 叶兰， 郑涛

(1.贵州医科大学 基础医学院 药理学教研室， 贵州 贵阳 550025； 2.贵州医科大学 基础医学院 机能学实验室， 贵州 贵阳 550025； 3.贵州中医药大学第一附属医院， 贵州 贵阳 550001)

子宫肌瘤又称子宫平滑肌瘤，是女性生殖器中最常见的良性肿瘤，临床常见的症状有子宫异常出血、压迫症状、疼痛以及生育能力丧失等，严重威胁女性健康[1]。研究表明，子宫肌瘤的发生和发展与子宫平滑肌细胞的过度增殖关系密切[2]。本研究采用细胞生物学与中药血清药理学相结合的方法[3]，观察妇科再造丸(FKW)含药血清对体外原代培养的子宫肌瘤细胞增殖和凋亡的作用及对其人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(PTEN)蛋白表达的影响，探讨FKW抗子宫肌瘤的作用机理，为FKW临床应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1标本收集 标本取自2015年1月-2017年4月因子宫肌瘤而行子宫全切或肌瘤剔除术的绝经前妇女，患者年龄35～50岁，术前3个月无类固醇激素使用史，术后经病理学诊断为子宫肌瘤。术中无菌条件下取子宫肌瘤组织1 cm3，置于3%双抗(青霉素、链霉素)的PBS 10 mL中，密闭冰浴条件下尽快送入细胞培养室。

1.1.2实验动物 清洁级3月龄Sprague-Dawley (SD)大鼠，雌性、体质量(200±20) g、合格证号SCXK(黔)2012-0001，由贵州医科大学实验动物中心提供。

1.1.3主要试剂与仪器 DMEM培养基(Hyclone)，胎牛血清(Hyclone)，DMSO(Sigma)，胰蛋白酶(Sigma)，MTT(Sigma)，Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(美国BD公司)；兔抗人平滑肌肌动蛋白单克隆抗体(Abcam)，PTEN抗体、PV6000免疫组化试剂盒及DAB(氨基联苯胺)显色试剂盒均购自北京中衫生物技术有限公司。酶标仪(BIO-RAD550型)，BDS200倒置生物学显微镜(重庆奥特光学有限责任公司)，流式细胞仪(Guava easyCyte)，CO2恒温培养箱(上海一恒科技有限公司)，QL-901旋涡振荡器(海门市麒麟医用仪器厂)等。

1.1.4药品 FKW(棕褐色丸剂)每10丸质量2.6 g，贵阳德昌祥药业有限公司生产，批号20151021，试验前用蒸馏水配制成高剂量112 g/L；中、低剂量组依次等比稀释1倍，浓度分别为56 及28 g/L；桂枝茯苓胶囊(GuiZhi Fu Lin Jiao Nang,GZFLJN)，连云港康缘制药股份有限公司生产，批号150106，临用前用蒸馏水配制成混悬液30 g/L。

1.2 方法

1.2.1FKW含药血清的制备 取健康雌性SD大鼠60只，随机分为无药血清组，FKW低、中、高剂量组，GZFLJN组，每组12只。每只大鼠灌注：无药血清组每次灌服生理盐水10 mL/kg；FKW高、中、低剂量组每次灌服相应药液10 mL/kg，分别为成人等效剂量12.9倍、6.5倍及3.2倍；GZFLJN组每次灌服相应药液10 mL/kg，为成人等效剂量6.4倍。各组大鼠给药2次/d，共3 d，第3天末次给药1 h后经股动脉取血，3 000 r/min离心20 min，分离血清，56 ℃恒温30 min灭活补体，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌分装，-20 ℃保存备用。

1.2.2人子宫肌瘤细胞原代培养及鉴定[4]将肌瘤组织在无菌条件下用3%双抗PBS液漂洗，在含DMEM培养液中剪碎为约1 mm3的组织块，每块间距2～3 mm摆放于培养瓶中，吸出培养液，轻轻翻转培养瓶使瓶底朝上后加入含10%胎牛血清的DMEM培养液，置于37 ℃、5% CO2培养箱内，4 h后将培养瓶翻正培养，每2～3 d换液1次，约3～4周出现致密细胞层时取出组织块，细胞生长融合达80%时，胰酶消化传代。选择生长良好、形态均一的第3～4代细胞用于后续实验。传代细胞均经α-actin(α-平滑肌肌动蛋白)免疫细胞化学法鉴定证实。

1.2.3子宫肌瘤细胞增殖活力检测 采用MTT比色分析法，将3～4代子宫肌瘤细胞消化成细胞悬液，调整浓度至6×109/L，每孔100 μL接种于96孔板(第一个孔留作空白)，于37 ℃、5% CO2中培养24 h，弃培养基后分别加入FKW低、中、高剂量组及GZFLJN组20%含药血清处理细胞，以加入20%无药血清组作为细胞对照，空白孔加入DMEM培养液作为空白对照，各设5个复孔，置正常条件下培养24、48及72 h，每孔加入5 g/L的MTT 20 μL，继续培养4 h后弃培养液，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150 μL，震荡混匀15 min，酶标仪在490 nm处测定吸光度(OD)值。并计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率(%)=(1-用药组OD值/细胞对照组OD值)×100%。

1.2.4子宫肌瘤细胞凋亡检测 采用Annexin V-FITC/PI双染色法流式细胞术，将第3～4次传代培养的子宫肌瘤细胞接种于5个6 cm培养皿(>1×105/皿)，随机分为细胞对照组、FKW低、中、高剂量组及GZFJN组，置37 ℃，5% CO2培养箱中培养24 h，依实验分组分别加入相应的20%无药血清及含药血清培养液，根据MTT结果采用经过各种药物干预72 h的子宫肌瘤细胞，加入适量0.25%胰酶消化收集细胞，制备浓度为1×108/L的细胞悬液，取1 mL细胞悬液，离心后去上清液，Annexin V buffer液100 μL重悬，在细胞悬液中分别加入Annexin V-FITC 5 μL避光孵育20 min再加碘化丙啶(PI)染色液5 μL，室温下避光孵育15 min，流式细胞仪检测；实验重复3次。

1.2.5PTEN表达 采用免疫细胞化学法，在6孔板中放上18 mm×20 mm的盖玻片，肌瘤细胞以1×107/L密度接种，每孔100 μL，按1.2.4项下分组，每组设3个复孔。待细胞贴壁后，加入相应的20%无药血清及含药血清培养液作用72 h，吸弃培养液，PBS冲洗3 min×2次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS冲洗5 min×3次，山羊血清封闭液孵育10 min，甩去多余液体，滴加一抗，4 ℃过夜，滴加二抗，二氨基联苯氨显色液(DAB)显色，脱水，封片。结果判断：DAB染色后阳性细胞细胞浆或细胞膜上出现棕黄色颗粒，采用图像分析软件计算阳性细胞的平均光密度值。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 人子宫肌瘤细胞原代培养及鉴定

培养第10天开始，组织块边缘有细胞游出，后随时间延长逐渐分裂，最终融合成片。胞体细长，为不规则三角形或梭形，细胞生长呈放射状或旋涡状。α-actin单克隆抗体免疫细胞化学染色证实培养的子宫肌瘤细胞在传代过程中始终保持平滑肌特性，肌瘤细胞纯度高，阳性细胞数接近100%，可用于后续的实验研究。

2.2 FKW含药血清对子宫肌瘤细胞增殖的影响

结果显示(见表1和图1)，FKW含药血清各剂量组干预24、48及72 h，各给药组OD值均较细胞对照组明显下降(P<0.05，或<0.01)，在同一时间点，随着FKW浓度的增加，其增殖抑制作用逐渐增强，细胞增殖抑制率逐步升高(P<0.05，或<0.01)；同一药液浓度下，各组作用72 h的抑制效应较作用24、48 h显著增强(P<0.05，或<0.01)，显示呈剂量和时间依赖性。因此，在后续研究中选取72 h为研究的有效作用时间点。

图1 药物对子宫肌瘤细胞的抑制率Fig.1 Drug inhibition rate of uterine leiomyoma cells

表1 FKW含药血清对子宫肌瘤细胞增殖的影响(n=5)Tab.1 Effects of FKW medicated serum on proliferation of human uterine leiomyoma cells

注：与细胞对照组比较,(1)P<0.05，(2)P<0.01；与FKW低剂量组比较,(3)P<0.01,(4)P<0.05；与FKW中剂量组比较,(5)P<0.05，(6)P<0.01；与24h处理组比较,(7)P<0.01,(8)P<0.05；与48h处理组比较,(9)P<0.05。

2.3 FKW含药血清对子宫肌瘤细胞凋亡率的影响

流式细胞仪检测显示，细胞对照组未见明显细胞凋亡，FKW含药血清各剂量组细胞凋亡率均显著高于细胞对照组(P<0.01)，且子宫肌瘤细胞凋亡率随着浓度的增高逐步增高，呈递增趋势，差异有统计学意义(P<0.01)。见图2。

注：(1)与细胞对照组比较, P<0.01；(2)与FKW低剂量组比较,P<0.01；(3)与FKW中剂量组比较， P<0.01。图2 FKW对子宫肌瘤细胞凋亡率的影响Fig.2 Effect of FKW medicated serum on apoptosis rate of uterine leiomyoma cells

2.4 FKW含药血清对子宫肌瘤细胞PTEN表达的影响

免疫细胞化学结果显示，PTEN蛋白阳性染色定位于平滑肌细胞质，呈棕黄色。FKW低、中、高剂量含药血清分别作用于子宫肌瘤细胞72 h时，均显著提高了PTEN蛋白的表达(P<0.01)，其中FKW高剂量组上调PTEN表达作用最为显著，与FKW低、中剂量组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。见表2、图3。

表2 FKW含药血清对子宫肌瘤细胞PTEN表达的影响(光密度,Tab.2 Effect of FKW medicated serum on the expression of PTEN protein of uterine leiomyoma cells

注：(1)与细胞对照组比较,P<0.01；(2)与FKW低剂量组比较,P<0.01；(3)与FKW中剂量组比较，P<0.01。

图3 各组子宫肌瘤细胞PTEN表达(免疫细胞化学染色，×100)Fig.3 Expression of PTEN protein detected by immunocytochemical staining

3 讨论

中医学认为子宫肌瘤属“积聚”、 “癥瘕”等范畴，其病机以血瘀为主，瘀血是癥瘕形成的重要因素和关键环节。FKW由当归、白芍、三七、丹参、益母草等42味中药组成，丹参破血去瘀，行气止痛；当归、三七补血、活血、止痛，白芍滋养阴血；全方合用能起消瘤散结、活血去瘀、理气消滞、清热解毒之功。FKW的临床反馈提示其对子宫肌瘤有一定疗效[5]，本课题组的前期研究亦表明，FKW对于雌、孕激素诱发的大鼠子宫平滑肌瘤样增生有显著的抑制作用[6]。

子宫肌瘤的发病机制复杂，与子宫平滑肌细胞过度增殖密切相关。本研究通过体外培养人子宫肌瘤细胞，建立子宫肌瘤细胞原代培养并传代，且保持良好的细胞形态和生化特点。在培养的子宫肌瘤细胞中应用FKW含药血清后发现：FKW含药血清以剂量-时间依赖性方式抑制子宫肌瘤细胞增殖，以FKW高剂量组作用72 h时抑制增殖作用最为显著；FKW含药血清干预72 h后，各给药组细胞凋亡率显著高于细胞对照组(P<0.01)，且随药物浓度增加呈递增趋势。上述研究表明FKW含药血清可抑制子宫肌瘤细胞的增殖，促进子宫肌瘤细胞凋亡，加速细胞凋亡过程，进而控制肌瘤的生长。

PTEN是一种具有磷酸酶活性的抑癌基因[7]，其产物PTEN蛋白具有脂质磷酸酶活性和蛋白磷酸酶活性，可通过拮抗酪氨酸激酶等磷酸化酶的活性而抑制肿瘤的发生发展[8-9]。磷酯酰肌醇-3-激酶(phosphatidyrlinositol-3-kinase，PI3K)/Akt信号通路是由PI3K家族与其下游的直接靶蛋白丝/苏氨酸蛋白激酶Akt或蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)组成，是重要的凋亡抑制通路，在调控肿瘤细胞的增殖、分化、存活和迁移等方面发挥作用[10]。PI3K/Akt信号通路的激活，可能通过调节其下游凋亡基因如bcl-2家族的活性、激活其下游分子Mtor、抑制糖原合成酶3的活性等机制而导致细胞存活及增殖，并保护细胞逃避凋亡[11-12]。PTEN的主要作用是对该通路产生负调控，实验证实，PTEN主要是通过其脂质磷酸酶活性作用于PI3K的下游靶分子三磷酸磷酯酰肌醇 (phosphatidylinosital triphosphate,PIP3)，从PIP3的3’去除磷酸将其转变成二磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositalbiphosphate,PIP2)，使Akt无法活化从而阻断PI3K/Akt信号通路的抗凋亡作用[13]。多种肿瘤中都可检测到PTEN的表达减少或缺失。有学者通过免疫组化的方法发现PTEN在正常子宫肌层中高表达，在子宫肌瘤组织中表达强度显著降低[14]，故认为PTEN在正常子宫肌层中通过阻断PI3K/Akt通路促进细胞正常凋亡，抑制细胞增殖；而在子宫肌瘤组织中由于表达降低而失去了对此通路的抑制，无法发挥其对细胞生长增殖的负性调节作用，因此促进了子宫肌瘤的发生发展。本研究发现，与细胞对照组比较，FKW含药血清各剂量组均能不同程度提高子宫肌瘤细胞PTEN表达(P<0.01)。

综上，本研究发现FKW含药血清抑制增殖和促进凋亡的作用可能是通过上调PTEN的表达，进而抑制PI3K/Akt信号通路的过度活化而实现的，其具体的作用机制需进一步深入研究。