荧光素酶标记小鼠结肠癌细胞建立活体成像移植瘤模型①

罗华灶 李 雪 依 含 谢 君 朱乃硕

(复旦大学生命科学学院微生物感染与分子免疫学实验室，上海200438)

结直肠癌(Colorectal cancer，CRC)是常见的消化道恶性肿瘤，发病率目前全球排名第四，死亡率高居第五位[1]。预计2030年，CRC病例将增加60%，新病例达到220万，死亡人数达110万[2]。其主要治疗方式为手术，但恶性程度高，术后易复发转移，近年来兴起的免疫疗法正掀起肿瘤治疗的革命[3,4]。小鼠由于与人类存在可比较的基因组大小，繁殖周期短，产仔数大，实验成本低且易于操作[5]，因此小鼠模型仍然是药物发现和新兴疗法的临床前评估的主要支柱[6,7]。开发用于研究的肿瘤异种移植动物模型的主要目的是联系基础和临床研究，也是对体外模型系统运用的很好补充[8]。结肠癌动物模型的建立是研究结肠癌体内发生、进展、侵袭转移及免疫治疗PD-L1抗肿瘤药物效果评估的重要手段[9]。尽管已有学者利用生物发光成像技术建立肿瘤移植模型，但诸多小鼠肿瘤模型尚缺乏动态连续追踪及量化分析[10]。理想的小鼠模型将一致地模拟人CRC的进展，应该在整个结肠和直肠中自发发展，在潜伏期短的动物中具有高发病率，遵循相同的转移模式，在具有免疫能力的动物中发生转移，允许无创监测疾病进展并具有相同的人类疾病分子特征[10]。目前的动物模型不能满足所有这些要求，但随着先进的成像模式，许多细胞系和先进的转基因建模方法可供选择。慢病毒可将目的外源基因整合进靶细胞基因组，实现靶细胞长期而稳定表达目的基因[11,12]，因此本研究采用三质粒慢病毒系统建立稳定整合及表达萤火虫荧光素酶基因的结肠癌细胞株，进行体外生长特性和PD-L1表达量的分析，并进行BALB/c鼠皮下移植瘤模型的构建，运用活体成像系统进行整体动态观察，从而为研究结肠癌的发生、进展机制及判断药物治疗效果提供全新的技术手段。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物及环境 CT26细胞和293T细胞购自上海中科院细胞库。BALB/c雌性小鼠，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，体重15～20 g，鼠龄 5～8周，饲养在复旦大学生命科学学院动物房平台SPF环境，按实验动物使用的“3R”原则给予动物人道的关怀。

1.1.2试剂与设备 1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素、链霉素和PBS购于Thermo公司；LipoFiterTM试剂购自汉恒生物；Polybrene、TritonTMX-100及PI染液购于Sigma；Puromycin购于Gibco；TransDetect Single-luciferase(Firefly)Reporter Assay Kit购于全式金；Luciferase Assay System，Luciferin(In vivo Grade)购自Promega公司；戊巴比妥钠购于德国默克公司；CCK-8试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司；BV421 Rat Anti-Mouse CD274(PD-L1)，BV421 Rat IgG2a λ Isotype Control，BD FACS Stain Buffer(FBS)购自BD；流式细胞仪Beckman Gallios 3L 10C，细胞计数仪Z2 coulter购自美国Beckman Coulter公司；Calibur流式细胞仪购自BD Pharmingen公司。倒置荧光显微镜购于德国Carl Zeiss公司；荧光素酶检测系统(GLOMAX 96 micro plate luminometer)购于Promega公司；活体成像系统(Night OWLⅡ LB983 NC100)购于德国Berthold公司。

1.2方法

1.2.1慢病毒的生产 转染前1 d将布满培养皿50%以上的293T细胞接种于24孔板中，转染时将完全培养基换成无血清培养基。将3质粒(psPAX2，pMD2.G以及pHBLVTM)与LipoFiterTM试剂按1∶1体积比混匀后加入293T细胞中，培养6～12 h，去除含LipoFiterTM-DNA的无血清培养基，并换完全培养基继续培养48～72 h，超速离心后取病毒上清，0.45 μm滤膜过滤，收集慢病毒原液，-80℃保存。

1.2.2感染及稳转细胞株的筛选 将生长状态良好的结肠癌细胞稀释至细胞密度为1.5×105ml-1接种于6孔板，每孔接种体积为2 ml，使得第二天细胞布满培养皿约60%左右，用收集的慢病毒感染细胞，感染时弃原有培养基，添加含5%FBS的新鲜培养液2 ml，按MOI=3的比例用慢病毒感染，并添加polybrene使得其最终浓度为7 g/ml。3 d后加12 g/ml 嘌呤霉素筛选。

1.2.3筛选细胞的放大培养 Puromycin筛完两代的存活率较好的细胞株，检测有过表达LUC则安排大量扩增细胞，待细胞长满后进行冻存，冻存细胞株后需进行复苏验证。

1.2.4CT26-LUC-1细胞株LUC活性检测

1.2.4.1CT26-LUC-1细胞克隆体外荧光值检测 细胞建株成功后检测荧光素酶活性。检测时，按1×104个/50 μl 细胞裂解液(Cell lysis buffer)裂解10 min，12 000 r/min，4℃离心10 min取上清；取 40 μl 细胞裂解液(即上述上清)放入黑色不透光96孔板；检测时每孔加入90 μl Luciferase Reaction Reagent工作液；移液枪吹打混匀2～3次，测定记录Luciferase值，设3个复孔；同时设置CT26-WT对照。

1.2.4.2不同数量的细胞克隆体外成像检测 将筛出的荧光素酶表达细胞株定名为CT26-LUC1细胞株，将CT26-LUC1细胞按细胞数5×105、2.5×105、1.25×105、6.25×104、3.12×104、1.56×104个分别接种到96孔黑板中，将未带荧光标记的CT26-WT细胞以相同的稀释倍数作为对照。另外设置2个复孔仅含培养基作为对照，培养贴壁后小心去掉上清，PBS洗一次，每孔加入100 μl PBS，再加入终浓度为150 μg/ml的D-Luciferin，孵育15 min后用活体成像系统检测，以每秒光子量(ph/s)表示，采用一元线性回归法分析荧光信号强度与细胞数之间的相关性。

1.2.5CT26-LUC1细胞与CT26-WT细胞生物学特性的比较

1.2.5.1细胞生长曲线 取生长状态良好的CT26-LUC1细胞和CT26-WT 细胞，接种于24孔板，接种密度为2×104个/孔。细胞接种后第1天到第7天，胰蛋白酶每天消化其中3孔细胞，用细胞计数仪Z2 coulter测定细胞数，绘制两种细胞生长曲线。

1.2.5.2CCK-8细胞增殖实验 将生长状态良好的CT26-LUC1细胞和CT26-WT细胞接种于96孔板中(2 000个/孔)，每孔含100 μl培养基。铺板后第1、2、3、4天每孔加入10 μl的CCK-8溶液，37℃孵育2～3 h后用酶标仪测定其OD450值，绘制增殖曲线。

1.2.5.3细胞周期检测 取生长状态良好的CT26-LUC1细胞和CT26-WT细胞，0.25%胰酶消化，离心弃上清液，PBS洗后加入PBS稀释的0.03% TritonTMX-100固定穿孔15 min后，将细胞离心弃Trixon 100后用PBS洗两次，加入PI染液，室温避光孵育15 min后，使用Calibur流式细胞仪检测，Modfit软件进行周期分析。

1.2.5.4表面PD-L1的流式分析 收集对数生长期的细胞，将100 μl FACS Stain Buffer中1×106个细胞与BV421 Rat Anti-Mouse PD-L1和BV421 Rat IgG2a λ Isotype Control同种型对照抗体在冰上避光孵育30 min后，将细胞重悬于500 μl FACS染色缓冲液中。使用Beckman Gallios 3L 10C仪器进行收集细胞，并使用FlowJo_V10软件分析结果。

1.2.6体内结肠癌模型的建立及生物发光活体成像 BALB/c鼠，5～6周龄，体重(15± 5)g。取对数生长期的CT26-LUC1克隆细胞，用PBS重悬为2.5×106ml-1，BALB/c鼠右背侧近腋部皮下接种200 μl。同时接种CT26-WT作为对照去除生物发光背景。接种后第7天采用活体成像系统检测信号强度。观测前BALB/c鼠先按150 mg/kg体重的量腹腔注射Luciferin，反应约5 min后腹腔注射戊巴比妥钠麻醉(50 mg/kg)，活体成像观察皮下肿瘤的荧光强度，观察并记录小鼠的生长状态。

1.2.7病理形态学观察 CT26-LUC1细胞BALB/c鼠皮下接种15 d后处死小鼠，取肿瘤组织，制成石蜡切片，切片方向为最大截面，厚度为3 μm，经HE染色后观察细胞的病理形态学，同时对CT26-WT细胞接种的皮下移植瘤进行HE染色观察。

2 结果

2.1筛选细胞的扩增培养的复苏验证 嘌呤霉素筛完两代的细胞株存活率均较好，检测有过表达LUC则安排大量扩增细胞，冻存细胞株后进行复苏验证，同野生型CT26细胞(图1A)对比，CT26-LUC1细胞系生长形态和状态良好，细胞存活率高且无污染，未见显著变化(图1B)。

2.2CT26-LUC1细胞体外荧光素酶(Luciferase)活性的检测和评估 经过嘌呤霉素筛选6 d后，进行CT26细胞体外荧光素酶(Luciferase)活性的检测，细胞悬液按1×104cell/50 μl细胞量浓度进行裂解后，发光强度为1.43×107，极显著高于CT26-WT细胞(图2A)。CT26-LUC1细胞在96孔板中经倍比稀释后， 荧光强度与细胞数呈现良好的相关性(R2=0.972 6)(图2B、C)。可见已获得能够稳定表达荧光素酶的结肠癌细胞株CT26-LUC1。

2.3CT26-LUC-1细胞模型的检测灵敏度 体外用活体成像系统Night OWLⅡ LB983 NC100可检测细胞数约为15 000个(图2A)。而CT26-LUC1细胞株在BALB/c小鼠体内接种2 d后，肿瘤体积约为3 mm3即可检测到荧光素酶信号(图2D)。

2.4稳定表达荧光素酶的CT26细胞系的生长特性及膜型PD-L1表达量 两种细胞CT26-WT与CT26-LUC1，所绘制的生长曲线基本重合，CT26-WT仅在第2天至第3天生长较CT26-LUC1生长稍快，最后在第5天后生长趋势趋向一致(图3A)，总体生长增殖能力差异无统计学意义(P>0.05)。类似生长趋势在CCK-8法绘制的细胞生长曲线中，在4 d的生长周期中，CT26-LUC1细胞与CT26-WT细胞生长趋势基本一致(图3B)，差异无统计学意义(P>0.05)。表明通过慢病毒感染的方法转染荧光素酶基因到细胞的过程中，并未对细胞本身的生长特性产生影响。CT26-LUC1组与CT26-WT均以G0/G1期细胞为主，各期细胞数未见显著性差异(P>0.05)(图3C)。而CT26结肠癌模型是肿瘤免疫应用于免疫检查点PD-1/PD-L1信号通路研究的常用肿瘤模型，其PD-L1的表达量是关注的重点，CT26-LUC1组与对照组细胞的PD-L1百分比分别为16.07±0.34、15.53± 0.40，差异无统计学意义(P>0.05)(图3D)。

2.5结肠癌皮下移植瘤模型的活体成像评估及肿瘤组织病理学观察 两组各3只BALB/c小鼠都成功接种成功，接种CT26-LUC1的小鼠与接种CT26-WT的小鼠相比，小鼠体重、活动情况、进食量及外表体征等均无不良影响，皮下荷瘤小鼠存活期长，接种CT26-LUC1的小鼠与接种CT26-WT的小鼠在15 d 观察期中体重呈小幅增长的趋势，且无显著性差异(图4A)。5×105个CT26-LUC1细胞皮下接种BALB/c鼠，成瘤率为100%。在接种第5天才能发现明显的肿块，但在接种CT26-LUC1细胞2 d后，活体成像系统即可检测到皮下较强的荧光信号，到第7天出现凸起的肿块时，荧光强度为2.4×104ph/s，而到肿瘤接种21 d后，中晚期肿瘤荧光强度为5.2×104ph/s，与早期肿瘤相比荧光强度已成倍增加(图4B)，肿瘤大小与荧光成像呈现很好的关系，并且能够发现肿瘤已经从接种部位转移至四周，说明稳定表达荧光素酶报告基因的鼠CT26-LUC1细胞从接种开始就能很好地反映肿瘤的生长，由此成功建立荧光素酶标记的小鼠结肠癌细胞活体成像移植瘤模型。CT26-LUC1细胞移植瘤镜下癌细胞排列呈团索状，大小形态各异，胞浆丰富，细胞核大深染，局部未染色可见坏死。与CT26-WT对照细胞没有差别(图4C)，符合结肠癌组织细胞特征，可见慢病毒转染荧光素酶基因对肿瘤细胞组织形态学无显著影响。

图1 CT26细胞系中稳定过表达LUC的细胞株扩增培养后复苏验证(×100)Fig.1 Confirmation of resuscitation after expansion of CT26 cell line stably overexpressing LUC(×100)Note: A.CT26-WT；B.CT26-LUC1.

图2 CT26-LUC1细胞克隆体外荧光活性检测Fig.2 CT26-LUC1 cell clone in vitro fluorescence acti-vity assayNote: A.Detection of luciferase fluorescence in vitro of CT26 cells imaging of different numbers of CT26-LUC1 live cells in vitro；C.Detection sensitivity of CT26-LUC1 cell line in BALB/c mice；D.Correlation analysis of luminescence signal intensity and cell number.***.P<0.001.

图3 CT26-LUC1细胞与CT26-WT细胞生长特性的比较Fig.3 Comparison of growth characteristics between CT26-LUC1 cells and CT26-WT cells Note: A.Comparison of cell proliferation curves between two groups (cells counting method)；B.Comparison of cell proliferation curves between two groups (CCK-8 method)；C.Detection of cell cycle distribution between the two groups；D.Detection of cell membrane type PD-L1 expression between the two groups；NS.Not significant.

图4 CT26-LUC1组与CT26-WT组BALB/c鼠皮下移植模型活体成像及病理检测Fig.4 In vivo images and histopathological detection of BALB/c mouse subcutaneous transplantation model of colon in CT26-LUC1Note: A.Mouse weight vivo imaging to detect the growth of subcutaneously inoculated CT26-LUC1 cells in BALB/c mouse；C.HE staining result of tumor tissue (×400)；NS.Not significant.

3 讨论

运用试验动物建立肿瘤模型可模拟活体状态下疾病的特征，为癌症的诊疗和抗肿瘤药物的研究提供试验材料[13]。既往动物实验实行人为肉眼观察、肿瘤称重、体积测量及组织切片病理观察，导致研究缺乏精确定量性、活体观察和整体性[14]，并且存在动物伦理学、实验误差及无法连续动态观察等诸多弊端[15]。生物发光成像技术是近年开发的一种直接测量活体动物中生物发光信号的新技术，实现了对小动物肿瘤模型实时、连续及非侵入性观察，能够在整体水平上动态监测动物中的肿瘤细胞生长、转移等情况[16-18]。理想的移植性肿瘤动物模型应该具有高重复性、高成瘤成功率及稳定的特点[19]。

CRC是全球癌症相关死亡的主要原因之一，其发病率和死亡率每年以3 %～4 %速度上升[20]。目前结直肠癌仍首推外科治疗，但是近年推崇的以PD-1/PD-L1为代表的免疫治疗在肿瘤治疗中展现了极其重要的作用，抑制/下调 PD-1/PD-L1信号通路能够有效提高对多种肿瘤的抗瘤效果[21，22]，尤其对结直肠癌效果更佳[23]，PD-1/PD-L1检查点抑制剂在dMMR(错配基因修复缺陷)结直肠癌患者中表现出治疗活性，而约95%的微卫星稳定性(Microsatellite stability，MSS)结肠癌患者中单独使用此类抑制剂时疗效甚微，但一项Atezolizumab联合MEK抑制剂Cobimetinib治疗MSS亚型的(非错配基因修复缺陷)结直肠的Ⅰ期临床试验被认为给不适合免疫治疗的结直肠癌患者带来了希望[24]。免疫治疗极大地改善了患者的生存质量和减少病患的痛苦及长期化疗放疗带来的身体伤害[25]，目前也正在探索奥沙利铂(OXA)联合PD-1/PD-L1抗体治疗CRC[26，27]。

当前致癌物诱导和基因工程小鼠模型在CRC发展和化学预防的研究中最有前景，而肿瘤移植模型适用于筛选候选治疗剂，皮下移植瘤用于在原位模型中的后续验证药物的高通量评估[10]，为每个实验应用选择最合适的动物模型，转化为与人体治疗CRC相似的结果是所有动物模型的最终目标。本研究利用慢病毒载体将荧光素酶基因和嘌呤霉素基因整合进入CT26细胞基因组中，我们通过提高嘌呤霉素筛选浓度，得到了高表达荧光素酶的阳性混合克隆，构建出稳定高表达LUC基因的CT26-LUC1细胞，重要的是膜型PD-L1表达量较CT26-WT没有任何差异，并且在BALB/c鼠接种后第2天就能检测到荧光信号，有利于肿瘤发生的早期研究和微小转移灶的发现[28]，且中晚期肿瘤的荧光成像与肿瘤生长情况呈现良好的相似性，而且能够清晰看到肿瘤的转移，该荧光素酶移植瘤模型具有高重复性、高成瘤成功率、稳定清晰的特点，保证了免疫检查点抑制剂在该高表达PD-L1移植瘤的响应[29，30]，并且能够及时迅速敏感直接地观测到肿瘤发生早期的治疗效果。该模型还将为结肠癌发生进展机制及PD-L1靶向药物的高通量筛选提供快速稳定可靠的动物研究模型，并且在原位模型难以进行候选药物的高通量评估方面提供强有力的支持，为肿瘤转移的相关遗传基因、肿瘤转移机制、新抗癌转移药物的发现等提供切实可靠且价格低廉的动物模型[31]。