类风湿性关节炎的IgG N-糖基生物标志物筛选①

李曰进 刘华民 纪 龙 徐希柱 刘雪贞 冯 霞 王友信 李 栋 王 嵬

(山东第一医科大学公共卫生学院，泰安271016)

类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性、进行性、自身免疫性疾病，以累及周身关节的滑膜炎导致关节肿痛为主要表现[1]。其病程较长，致残率高，严重影响患者的生活质量[2]。RA在世界范围内的患病率已达2%，中国人群患病率已达1%，且女性较多见[3,4]。RA的发病机制目前尚未清楚，病因复杂，与遗传易感性、环境因素、免疫异常、饮食习惯以及心理社会因素等有关[5-7]。

已有研究显示，RA 与IgG糖链结构异常有关，IgG Fc段连接的糖基结构的微小变化可以影响Fc段的构型，从而改变甚至逆转IgG的分子功能[8]。如糖基末端增加唾液酸和半乳糖，IgG与Fc受体结合能力减弱，导致自身抗体性炎症反应减弱，调控IgG抗体的促炎功能转变为抗炎功能;IgGN-糖基缺少核心岩藻糖修饰，抗体依赖的细胞介导的毒作用(Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)增强，导致自身免疫性疾病发生[9,10]。目前研究已经证实，异常IgGN-糖基化水平与多种炎症性和自身免疫性疾病存在关联，可以作为疾病诊断或预后的分子生物标志物[11-14]。本研究拟通过分析类风湿性关节炎和正常人群组间血浆 IgGN-糖基水平差异，利用ROC曲线探讨类风湿性关节炎的潜在糖基生物标志物，为阐明类风湿性关节炎发生发展机制提供理论基础。

1 资料与方法

1.1研究对象 选取2014年中国唐山市冀东油田医院体检人群，纳入研究。排除标准：①患有心血管、呼吸系统、泌尿生殖系统、消化系统、血液和癌症等任何严重疾病的患者；②无个人信息和血液样本。类风湿性关节炎诊断标准：①晨僵至少持续1 h；②有3个或3个以上的关节同时肿胀或有积液；③掌指关节、近端指间关节或腕关节中至少有1个关节肿胀或有积液；④在二项所列举的关节中，同时出现对称性肿胀或积液的关节；⑤皮下类风湿结节；⑥类风湿因子阳性；⑦手和腕的后前位X线照片显示有骨侵蚀或有明确的骨质疏松。以上 1～4条必须持续出现至少6周或12周；具备4条或4条以上者，可诊断为类风湿性关节炎。

共计纳入318例研究对象，年龄10～73岁，平均为(47.12±8.43)岁，其中男性42例(13.21%)，女性276例(86.79%)。RA组123例(38.68%)，对照组195例(61.32%)；RA组平均年龄为(50.69±11.53)岁，对照组平均年龄为(44.86±4.40)岁；RA组男性18例(14.63%)，女性105例(85.37%)。

1.2方法

1.2.1样本采集及处理方法 使用乙二胺四乙酸二钠(Ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)真空采血管采集研究对象晨起空腹肘部外周静脉血液样本5 ml用于N-糖基组学分析，立即置于冰盒中保存运送。血液样本在低温离心机内4℃ 3 000 r/min离心10 min，用移液器吸取上层血浆样本，分装于3个1.5 ml离心管，置于-80℃低温冰箱中保存备用。

1.2.2糖基检测方法 采用亲水交互高效液相色谱-超高效液相色谱法(Hydrophilic interaction high performance liquid chromatography-ultra performance liquid chromatography，HILIC-UPLC)对血浆IgGN-糖基进行定量检测，该方法是一种基于96孔G蛋白单片板的高通量、自动分析技术。该方法的简要流程为：①制备96孔板Protein G提取；②IgG分离；③IgG去糖基化；④糖链标记及纯化；⑤液相色谱与电喷雾质谱联用(LC-ESI-MS)检测分析。最终得到24个不同的色谱峰,由于GP3相对峰下面积最小，故将GP3排除分析。在直接测得的24个色谱峰基础上，根据文献报道，计算糖基衍生结构[15]。

2 结果

2.1IgGN-糖基直接测量指标组间差异比较 如表1所示，在类风湿性关节炎组和对照组中，GP4、GP8和GP14糖基峰的含量为最多，约占各组总糖基峰的50%。GP1、GP2、GP4-GP6、GP11、GP19、GP22和GP24均为RA组高于对照组(P均<0.05)；GP9、GP12-GP18和GP20为RA组低于对照组(P均<0.05)，差异均具有统计学意义。

2.2血浆IgGN-糖基与类风湿性关节炎相关性 校正年龄和性别因素后，GP1、GP2、GP4-GP6、GP11、GP19和GP24均与RA疾病呈正相关(P均<0.05)；GP9、GP12-GP15、GP17、GP18和GP20均与RA疾病呈负相关(P均<0.05)；G0n(无半乳糖基化)和Gal-ratio(无半乳糖基化的糖基结构所占比例)为RA疾病的危险因素，OR值分别为5.75(95%CI 3.71～8.92)和8.53(95%CI 4.86～14.95)；G1n(单半乳糖基化)和G2n(双半乳糖基化)为RA疾病的保护因素，OR值分别为0.59(95%CI 0.45～0.77)和0.19(95%CI 0.12～0.29)；FtotalS1/FtotalS2和FS1/FS2均为RA疾病的保护因素，OR值分别为0.18(95%CI 0.11～0.29)和0.33(95%CI 0.23～0.47)(表2)。

表1 类风湿关节炎组和对照组IgGN-糖基水平差异比较

Tab.1 Comparison of IgGN-glycosylation levels between rheumatoid arthritis group and control group

IgG N-glycansStructureRheumatoid arthritis(n=123)x±sM(QR)Control(n=195)x±sM(QR)P valueGP10.16±0.090.14(0.11)0.07±0.030.06(0.04)<0.0011)GP20.82±0.470.70(0.68)0.50±0.250.43(0.30)<0.0011)GP423.69±7.4522.92(9.81)16.04±4.1515.51(5.22)<0.0011)GP50.20±0.070.18(0.06)0.15±0.060.13(0.04)<0.0011)GP65.14±1.205.09(1.68)4.05±0.983.93(1.22)<0.0011)GP70.51±0.220.44(0.25)0.47±0.200.45(0.23)0.2821)GP818.95±1.8218.98(2.35)18.89±1.6618.92(2.19)0.7542)GP98.94±1.408.73(2.07)9.26±1.299.23(1.69)0.0342)GP104.65±0.834.65(1.29)4.65±0.904.51(1.01)0.5841)GP110.58±0.130.56(0.15)0.51±0.110.49(0.14)<0.0011)GP121.08±0.610.91(0.78)1.51±0.691.43(0.91)<0.0011)GP130.28±0.070.28(0.08)0.31±0.720.30(0.08)<0.0011)GP1414.06±4.1513.98(5.64)19.79±3.3420.12(4.70)<0.0011)GP151.81±0.411.80(0.54)2.07±0.382.08(0.55)<0.0012)GP162.72±0.492.67(0.54)2.80±0.482.81(0.63)0.1642)GP171.01±0.270.96(0.35)1.11±0.331.06(0.42)0.0071)GP189.54±2.879.09(3.88)12.56±2.3912.60(4.06)<0.0012)GP191.69±0.481.60(0.48)1.36±0.231.35 (0.27)<0.0011)GP200.28±0.080.27(0.09)0.31±0.080.30 (0.10)0.0011)GP210.49±0.100.48(0.12)0.49±0.080.49 (0.08)0.3111)GP220.09±0.030.09(0.04)0.08±0.020.08 (0.02)0.0111)GP231.65±0.421.61(0.53)1.68±0.321.69 (0.40)0.1881)GP241.46±0.461.40(0.50)1.15±0.231.12 (0.31)<0.0011)

表2 血浆IgGN-糖基指标与类风湿性关节炎的相关性

Tab.2 Correlation between plasma IgGN-glycosylation index and rheumatoid arthritis

IgG N-glycanscOR value(95%CI)aOR value(95%CI)PGP118.57(9.28-37.13)17.52(8.72-35.22)<0.0011)GP22.69(1.99-3.64)2.31(1.68-3.190<0.0011)GP45.53(3.66-8.35)5.18(3.36-8.00)<0.0011)GP52.31(1.67-3.20)2.03(1.47-2.8)<0.0011)GP62.95(2.19-3.97)2.54(1.84-3.49)<0.0011)GP90.78(0.62-0.98)0.74(0.58-0.95)0.0181)GP111.88(1.45-2.44)1.60(1.22-2.10)0.0011)GP120.45(0.34-0.61)0.51(0.38-0.70)<0.0011)GP130.63(0.48-0.83)0.67(0.50-0.88)0.0041)GP140.16(0.11-0.24)0.16(0.10-0.24)<0.0011)GP150.48(0.37-0.63)0.55(0.42-0.73)<0.0011)GP170.70(0.51-0.90)0.76(0.58-0.99)0.0421)GP180.26(0.19-0.37)0.29(0.21-0.42)<0.0011)GP193.31(2.31-4.74)2.78(1.94-3.99)<0.0011)GP200.68(0.53-0.87)0.77(0.59-1.00)0.0461)GP221.38(1.09-1.73)1.25(0.98-1.60)0.068GP243.02(2.16-4.22)2.59(1.84-3.64)<0.0011)GalactosylationG0n5.99(3.97-9.05)5.75(3.71-8.92)<0.0011)G1n0.57(0.44-0.74)0.59(0.45-0.77)<0.0011)G2n0.18(0.12-0.27)0.19(0.12-0.29)<0.0011)Gal-ratio8.82(5.21-14.93)8.53(4.86-14.95)<0.0011)SialylationFtotalS1/FtotalS20.16(0.10-0.25)0.18(0.11-0.29)<0.0011)FS1/FS20.28(0.19-0.39)0.33(0.23-0.47)<0.0011)FucosylationFntotal1.15(0.92-1.46)1.16(0.91-1.48)0.24Fn0.86(0.68-1.07)0.94(0.74-1.20)0.63

Note：cOR represents the odds ratio after unadjusted age and gender；aOR represents the odds ratio after adjusting for age and gender；1)P<0.05,the difference was statistically significant.

图1 IgG N-糖基诊断类风湿性关节炎的ROC曲线图Fig.1 ROC curve of IgG N-glycosylation for diagnosis of rheumatoid arthritisNote: A.ROC plot for the diagnosis of RA with a single glycan-based indicator；B.A graph of the combined diagnosis of RA with a glycosylation index.

2.3血浆IgGN-糖基生物标志物筛选 与类风湿性关节炎相关的糖基指标经逐步回归筛选后，模型最终纳入4个变量(GP1、GP2、GP4和GP24)。单个IgGN-糖基指标诊断RA的ROC曲线下面积分别为：GP1(AUC=0.880，95%CI 0.836～0.925)、GP2(AUC=0.759，95%CI 0.695～0.822)、GP4(AUC=0.840，95%CI 0.789～0.891)和GP24(AUC=0.772，95%CI 0.713～0.831)(图1A)。糖基指标联合ROC曲线下面积AUC=0.919(95%CI 0.883～0.954)(图1B)。

3 讨论

本研究结果显示，调整年龄和性别因素后，有16个糖基直接指标与6个衍生指标在类风湿性关节炎组和对照组之间存在统计学差异。在16个糖基直接指标中，相比于对照组，高水平的GP1、GP2、GP4、GP6和GP24能增加类风湿性关节炎的患病风险，GP9、GP12、GP13、GP15、GP17、GP18和GP20是类风湿性关节炎的保护性因素。GP1、GP2、GP4和GP6是末端没有半乳糖基化和唾液酸化修饰的糖基结构，GP9、GP12、GP13及GP15是末端有半乳糖基化修饰的糖基结构，GP17、GP18、GP20及GP24都是末端含有唾液酸化修饰的糖基结构。因此，提示我们半乳糖基化及唾液酸化水平降低会增加类风湿性关节炎的患病风险。在6个衍生指标中，G0n(无半乳糖基化)和Gal-ratio(无半乳糖基化的糖基结构所占比例)水平升高会增加RA患病风险，G1n(单半乳糖基化)和G2n(双半乳糖基化)水平降低会增加RA患病风险；唾液酸化水平(FtotalS1/FtotalS2和FS1/FS2)降低会增加RA患病风险。 本次研究发现，GP1、GP4、GP6、GP11、GP19及GP24糖基峰均在类风湿性关节炎患者中水平升高，虽然以上糖基峰均含有核心岩藻糖基结构，然而相比于对照组，其他含有核心岩藻糖基结构的糖基峰(GP14、GP15、GP18和GP20)以及不含核心岩藻糖基结构的糖基峰(GP12、GP13)在RA患者中水平较低，因此尚不能得出核心岩藻糖基化水平升高或降低会增加类风湿性关节炎的患病风险。

血浆IgGN-糖基的特定谱型可及时反映机体多种生理和病理改变，复杂的糖基标志物能更好地描述机体状态。已有研究表明，IgGN-糖基指标较传统生物标志物有更高的灵敏度和特异度，可以提供更加准确的疾病预测信息[14]。此次研究发现，单个糖基指标GP1对RA的诊断效力最大(AUC=0.880，95%CI 0.836～0.925)；而糖基指标联合诊断效力可达0.923，因此我们认为血浆IgGN-糖基有望作为类风湿性关节炎的诊断分子标志物，有助于实现类风湿性关节炎疾病的早期预警，为进一步探索糖基组学与类风湿性关节炎的早期诊断提供理论基础。