姜黄素腹腔注射对哮喘小鼠的防治作用及其机制

周好好，黄翠萍

(1湖北医药学院，湖北十堰442000；2湖北科技学院)

哮喘是一种免疫功能异常的变态反应性疾病，气道炎症是其发病机制之一。微小RNA-155(miR-155)是位于人类第21号染色体的BIC基因外显子3编码的一种多功能RNA，其与癌症、免疫性疾病等相关[1]，与哮喘气道炎症关系密切。p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)信号通路可通过介导细胞凋亡、促进各种细胞因子的合成和炎症细胞的募集等,在哮喘的发生中起至关重要的作用。研究发现，姜黄素是天然植物多酚化合物，可有效缓解气道阻塞、气道高反应性和炎症细胞浸润等[2,3]。姜黄素可诱导肿瘤细胞内miRNA表达发生变化，其是否影响miR-155-5P的表达尚未可知，在哮喘发病过程中对p38 MAPK信号通路作用的研究也较少。2017年10月～2018年3月，本研究观察了姜黄素腹腔注射对哮喘小鼠的防治作用，并探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂及仪器 SPF级雌性健康BALB/c小鼠28只，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号：11400700254656，6～8周龄，体质量(20±2)g。鸡卵清蛋白(OVA)(德国Sigma公司，纯度62%～88%)，4%氢氧化铝凝胶(西安赫特生物科技有限公司，500 mL)，Mmu-miR-155-5p探针法RT-PCR试剂盒(GenePharma公司)，兔抗p38、兔抗磷酸化p38(CST)。402AI超声雾化器(上海鱼跃医疗设备有限公司)，多功能酶标仪(美国Bio-Tek公司)，RT-PCR仪(美国Bio-Tek公司)，3-18K高速冷冻离心机(德国Sigma公司)。

1.2 动物分组、模型制备及药物干预 28只小鼠适应环境7 d后随机分为正常对照组、模型组、姜黄素低剂量组、姜黄素高剂量组，每组7只。模型组、姜黄素低剂量组、姜黄素高剂量组根据文献[4]分致敏和激发两个阶段制备哮喘模型。第0、7、15天致敏3次，正常对照组腹腔注射生理盐水，其余各组腹腔注射致敏液(含OVA 4 mg+氢氧化铝150 μL)0.2 mL。第22～27天为激发阶段，将小鼠置于雾化箱内(20 cm×20 cm×30 cm)，每天雾化40 min，正常对照组用生理盐水溶液作为雾化溶液，其余各组使用10% OVA生理盐水作为激发液。每次激发前30 min，正常对照组、模型组腹腔注射生理盐水0.3 mL，姜黄素低、高剂量组分别腹腔注射100、200 mg/kg姜黄素各0.3 mL。观察各组哮喘发作表现。

1.3 标本采集及处理 各组末次激发24 h后，10%水合氯醛经腹腔注射0.1 mL麻醉，处死小鼠，取其右肺门中叶，用生理盐水冲洗，经10%多聚甲醛固定24 h，做3 μm厚切片，用于苏木素-伊红染色，观察形态学变化，其余肺组织用生理盐水冲洗后，液氮速冻，保存于-80 ℃冰箱。

1.4 肺组织病理变化观察 采用HE染色法。取出10%多聚甲醛固定的肺组织，经组织脱水、透明、浸蜡、包埋、切片脱蜡后，用苏木素染液染色，分化漂洗，伊红复染，透明封固，风干后中性树胶封片。于倒置相差显微镜下(200倍)观察各组气道结构有无破坏，气道壁及气道平滑肌是否增厚，支气管壁及血管壁周围有无炎症细胞浸润。

1.5 肺组织中miR-155-5p表达检测 用RT-PCR法。检测试剂盒购自GenePharma，按说明书进行操作。TRIzol法提取RNA，反应体系(RNA 2 μL+Random N6 5 μL)加热70 ℃ 5 min，放于冰盒上，反应物体系20 μL：dNTP 0.75 μL+5×MMLV RT Buffer 4 μL+MMLV Reverse Transcriptase 0.2 μL+ Ribonuclease Inhibitor 0.5 μL，反应条件：37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 min。聚合酶链反应：miR-155-5p引物购自吉玛基因股份有限公司，用GAPDH做参照，反应体系20 μL：cDNA 2 μL、2×Real-time PCR Master Mix 10 μL、miRNA&U6 snRNA specific primer set 0.4 μL、miRNA&U6 snRNA specifir probe 0.4 μL、ROX Reference 校准染料(50×)0.4 μL、Taq DNA 聚合酶(5U/μL)0.2 μL+Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)6.6 μL。反应条件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 12 s，62 ℃ 40 s，40个循环。用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。

1.6 肺组织中磷酸化p38 MAPK蛋白表达检测 采用Western blotting实验。取冻存的肺组织50 mg，放入匀浆器于冰上进行碾压，加入400 μL裂解液(RIPA 1 mL+PMSF 10 μL+磷酸酶抑制剂10 μL)冰上裂解30 min，将裂解液移至1.5 mL离心管中，4 ℃下12 000 r/min离心5 min，取上清即为总蛋白,-20 ℃保存备用，BCA法测蛋白浓度。将提取的蛋白加入蛋白上样缓冲液，放入沸水中10 min，变性完后冷却至室温再放入-20 ℃保存。上样蛋白量40 μg，5%浓缩胶、12%分离胶进行SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，磷酸化p38 MAPK用1%～3%的BSA浸泡PVDF膜，室温摇床封闭2 h。一抗磷酸化p38 MAPK(1∶1 000)，于4 ℃摇床孵育过夜，次日室温下洗膜，HRP标记羊抗兔二抗(1∶50 000)，37 ℃摇床孵育2 h。TBST洗膜，DAB显色。以β-actin做参照，用多功能酶标仪测定各条带吸光度(OD)值作定量分析。

2 结果

2.1 各组哮喘发作表现比较 致敏阶段，各组表现均无异常。激发阶段，模型组出现打喷嚏、搔鼻、安静少动、点头样喘息等典型的哮喘症状，而姜黄素低剂量组、姜黄素高剂量组哮喘症状不明显，正常对照组表现无异常。

2.2 各组肺组织病理变化比较 正常对照组气道黏膜完整，支气管壁及血管壁周围无炎症细胞浸润；模型组气道壁及气道平滑肌增厚，支气管壁及血管壁周围大量炎症细胞浸润；姜黄素低剂量组、姜黄素高剂量组气道壁及气道平滑肌增厚不明显，支气管壁及血管壁周围少量炎症细胞浸润。

2.3 各组肺组织中miR-155-5p、磷酸化p38 MAPK蛋白表达比较 与正常对照组比较，模型组肺组织中miR-155-5p、磷酸化p38 MAPK蛋白相对表达量高(P均<0.05)；与模型组比较，姜黄素高剂量组肺组织中miR-155-5p、磷酸化p38 MAPK蛋白相对表达量低(P均<0.05)，姜黄素低剂量组与模型组比较、姜黄素低剂量组与姜黄素高剂量组比较差异无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 各组肺组织中miR-155-5p与磷酸化p38 MAPK蛋白相对表达量比较

2.4 肺组织中miR-155-5p与磷酸化p38 MAPK蛋白表达的相关性 肺组织中miR-155-5p表达与磷酸化p38 MAPK蛋白表达呈正相关(r=0.870，P<0.01)。

3 讨论

哮喘是一种多细胞慢性炎症性疾病，其关键作用细胞包括嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞以及T淋巴细胞。支气管哮喘的炎症进程与黏液高分泌、气道重塑和气道高反应相关。

miRNA是免疫系统中重要调节因子，在过敏性气道炎症中发挥重要作用[5,6]。miR-155在活化的B细胞、T细胞、树突状细胞和巨噬细胞中高表达。Calame[7]认为，miR-155是清除病原体和凋亡细胞免疫效应阶段的关键调节剂，参与B细胞成熟、分化和感染反应期间的抗体类转换。据报道，糖皮质激素通过下调miR-155表达来减弱脂多糖诱导的炎症反应及败血症。糖皮质激素的抗炎作用可通过抑制miR-155的表达来逆转，因此，类固醇抑制miR-155表达可能是免疫反应相关的新途径[8]。同时，人类基因Bic/miR-155与哮喘、花粉过敏症相关基因均位于染色体21q21区域，提示哮喘的发生发展与miR-155密切相关[9]。miR-155-5p是miR-155亚型之一，在哮喘小鼠肺组织中表达上调，抑制miR-155-5p表达有助于改善小鼠哮喘症状，降低炎症因子表达[1]。

MAPK是一种在进化上非常保守的信号分子，在哮喘进展中发挥重要作用。其成员之一p38 MAPK与炎症、应激反应的调控密切相关。研究表明，p38 MAPK信号通路可介导细胞凋亡、促进各种细胞因子的合成和炎症细胞的募集等，在哮喘的炎症反应中起至关重要的作用[10]。p38 MAPK抑制剂通过抑制糖皮质受体的磷酸化，进而促使其核转移，从而恢复糖皮质激素的敏感性。相关研究提示，p38 MAPK抑制剂在纠正难治性哮喘糖皮质激素敏感性中发挥重要作用[11]。

姜黄素是一种来自姜黄的抗氧化多酚，是咖喱香料姜黄的主要成分。研究表明,姜黄素具有化学预防、抗肿瘤细胞增殖与转移、促肿瘤细胞凋亡、抗血管生成和抗炎作用[12]，对胃肠道、肾脏和心血管无不良反应[13，14]。姜黄素可有效缓解哮喘小鼠模型的气道阻塞、气道高反应、炎症细胞浸润，降低Th2类细胞因子的异常高表达等。在脂多糖刺激的人全血中，姜黄素抑制由内源性或外源性花生四烯酸产生的环氧合酶2(COX-2)衍生的前列腺素E2(PGE2)形成，抑制COX-2和微粒体PGE2合酶1的表达，从而通过抑制COX-2的表达降低PGE2的形成。姜黄素诱导肺癌细胞A549中has-miR-186-3p表达下调，增加靶蛋白caspase-10的表达，从而促进肺癌A549细胞凋亡[15]；可通过上调has-miR-7-5p表达来抑制胰腺癌细胞的增殖、迁移[16]； has-miR-489-3p与has-miR-486-3p差异表达可能与姜黄素的抗肿瘤作用有关[17]。

本研究检测小鼠肺组织中miR-155-5p、磷酸化p38 MAPK蛋白的表达。结果发现，姜黄素干预组哮喘症状缓解，同时肺组织中miR-155-5p、磷酸化p38 MAPK蛋白表达较模型组低，提示姜黄素减轻小鼠哮喘症状的机制可能与干扰miR-155-5p、磷酸化p38 MAPK蛋白表达相关。此外，miR-155-5p和磷酸化p38 MAPK的表达呈正相关，miR-155-5p可能通过调控磷酸化p38 MAPK途径参与哮喘发病过程。

本研究证实，姜黄素预注射可减轻哮喘小鼠的哮喘症状及肺损伤，其机制可能与调控miR-155-5p、磷酸化p38 MAPK表达有关。本研究仅选择两种剂量的姜黄素进行研究，未对其他剂量姜黄素的效果进行观察，后期研究将增加其他剂量的分组，进一步完善结果。