痴呆患者血清miR-9、miR-34c表达变化及意义

潘晓峰，刘文娟

(1丹东市第一医院，辽宁丹东118000；2哈尔滨医科大学附属第二医院)

痴呆是临床常见的进行性中枢神经系统退行性疾病，临床主要表现为渐进性记忆衰退、认知功能障碍、语言障碍等[1,2]，该病多发于65岁以上老年人。我国痴呆患者居全球首位，高达950万，据估计，到2050年将增至3 000万[3]。痴呆发病机制尚不明确，其早期诊断缺乏特异性生物标志物。大部分患者确诊时已进展至临床症状明显阶段，神经系统损伤明显，预后较差。寻找灵敏度、特异度高的标志物辅助临床早期诊断并评估患者病情严重程度，对制订针对性治疗方案，改善病情有重要意义。微小RNA(miRNA)主要存在于真核生物中，是长度为18～25个核苷酸的小分子单链非编码RNA，通过完全或不完全方式与其靶mRNA3′UTR配对，从而降解mRNA或抑制蛋白质翻译[4]。miRNA不仅介导了细胞增殖、分化以及凋亡等生理活动，还参与了恶性肿瘤病理过程的发生发展[5]。miRNA与精神分裂症、帕金森病等神经系统疾病密切相关[6,7]。研究显示，miR-9、miR-34c参与了恶性肿瘤的生物学进程[8,9]，但二者在痴呆发病中的作用，目前研究较少。本研究观察痴呆患者血清miR-9、miR-34c表达变化，并探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2017年3月～2019年3月丹东市第一医院神经内科收治的135例痴呆患者，纳入标准：①符合美国国家衰老研究所与阿尔茨海默病学会对痴呆的诊断标准[10]；②临床痴呆分级量表(CDR)评分[11]≥1分；③简易精神状态检查量表(MMSE)[12]评分<24分；④符合医学伦理学要求；⑤患者家属知情同意，并签署知情同意书。排除标准：①心功能不全；②肝肾功能障碍；③患精神分裂症、抑郁症等精神类疾病；④伴高血压、糖尿病等慢性疾病；⑤患急、慢性免疫性疾病及炎症反应性疾病；⑥有脑梗死、脑出血等脑部疾病史；⑦恶性肿瘤；⑧患有其他可能影响本研究结果的疾病。根据CDR评分将其分为轻度痴呆组(n=59，CDR评分=1分)、中度痴呆组(n=45，CDR评分=2分)、重度痴呆组(n=31，CDR评分=3分)。轻度痴呆组男32例、女27例，年龄(72.83±6.14)岁，BMI(22.56±2.37)kg/m2；中度痴呆组男28例、女17例，年龄(71.05±6.92)岁，BMI(21.89±3.06)kg/m2；重度痴呆组男19例、女12例，年龄(73.39±7.11)岁，BMI(23.02±2.67)kg/m2。并于同期随机选取60例健康体检者为对照组，排除痴呆、高血压、糖尿病等慢性疾病；心功能不全、肝肾功能障碍、急慢性免疫系统疾病及炎症性疾病。其中男37例、女23例，年龄(70.55±6.34)岁，BMI(23.15±2.30)kg/m2。各组性别分布、年龄、BMI比较差异无统计学意义(P均>0.05)。

1.2 血脂、血清脂联素(ADP)及血清同型半胱氨酸(Hcy)水平检测 采集痴呆患者入院次日及对照组体检时清晨空腹肘静脉血5 mL，以3 000 r/min离心10 min，离心半径12 cm，留取上清液置于-80 ℃环境下保存，留待检测。采用罗氏P800全自动生化分析仪检测血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)，试剂盒由北京九强生物科技有限公司提供；采用双抗体夹心法检测血清ADP，试剂盒由武汉博士德公司提供；采用酶联免疫吸附法检测血清Hcy，试剂盒由上海东方顺宇生物科技有限公司提供。上述检测过程严格按照试剂盒相关说明进行操作。

1.3 认知功能评价 采用MMSE评分。内容主要包括定向力(10分)、注意力和计算力(5分)、记忆力(3分)、语言表达能力(9分)、回忆力(3分)，满分30分，分数与认知功能呈正比。

1.4 血清miR-9、miR-34表达检测 采用实时荧光定量PCR法(RT-qPCR)。用RNA提取试剂盒(德国凯杰公司)提取血清总RNA，用ARLC&2100B仪(美国Agilent公司)分析样本的RNA浓度以及纯度，将其于低温环境下保存。按照miScript Ⅱ RT Kit说明书进行操作，将纯化后的cDNA溶入20 μL RNase-Free dd H2O中，反应体系：RNA 500 ng，5×miScript RT Buffer 1 μL，miScript Reverse Transcriptase Mix 1 μL，最后加入H2O使其体积达20 μL，混匀后孵育进行反转录。将适量cDNA加入去RNase的PCR管中，内参基因为U6，其上游引物序列：5′-TGCGGGTGCTCCGCTTCGGC-3′，下游引物序列：5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGTCT-3′，长度为265 kb；miR-9上游引物序列：5′-CGGAGATCTTTTCTCTCTTC-3′，下游引物序列：5′-CAAGAATTCGCCCGAACCAG-3′，长度为249 kb；miR-34c上游引物序列：5′-ACGCGTCGACATGTCTCAGT-3′，下游引物序列：5′-CGGGATCCTCATTCAGCAGA-3′，长度为256 kb。引物序列由Invitrogen公司合成。cRT-qPCR反应体系：2×QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，10×miScript Universal Primer 2 μL，10×miScript Primer Assay引物2 μL，模板cDNA 2 μL，无酶RNA H2O 4 μL。反应条件：95 ℃预变性1 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，循环40次。用2-△△CT法计算miR-9、miR-34c相对表达量。实验重复3次取平均值。

2 结果

2.1 各组血脂、ADP、Hcy水平及MMSE评分比较 各组HDL-C、LDL-C、ADP、Hcy、MMSE评分比较差异有统计学意义(P均<0.05)，各组TC、TG比较差异无统计学意义(P均>0.05)，各指标组间两两比较见表1。

表1 各组血脂、ADP、Hcy水平及MMSE评分比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与轻度痴呆组比较，#P<0.05；与中度痴呆组比较，△P<0.05。

2.2 各组血清miR-9、miR-34c表达比较 各组血清miR-9、miR-34c表达比较差异有统计学意义(P均<0.05)，组间血清miR-9、miR-34c表达两两比较见表2。

表2 各组血清miR-9、miR-34c表达比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与轻度痴呆组，#P<0.05；与中度痴呆组，△P<0.05。

2.3 痴呆患者血清miR-9、miR-34c表达与HDL-C、LDL-C、ADP、Hcy、MMSE评分的相关性 Pearson积矩相关分析结果显示，痴呆患者血清miR-9与HDL-C、ADP、MMSE评分呈正相关(P均<0.05)，与LDL-C、Hcy呈负相关(P均<0.05)；血清miR-34c与HDL-C、ADP、MMSE评分呈负相关(P均<0.05)，与LDL-C、Hcy呈正相关(P均<0.05)。见表3。

2.4 血清miR-9、miR-34c对痴呆的诊断价值 绘制ROC曲线，结果显示，血清miR-9诊断痴呆的ROC曲线下面积(AUC)为0.811(95%CI：0.720～0.902)，约登指数为0.81，截断值为0.82，灵敏度、特异度分别为0.82、0.79，准确性为0.83；血清miR-34c诊断痴呆的AUC为0.838(95%CI：0.751～0.925)，约登指数为0.85，截断值为1.01，灵敏度、特异度分别为0.85、0.83，准确性为0.89；血清miR-9联合miR-34c诊断痴呆的AUC为0.923(95%CI：0.872～0.975)，灵敏度、特异度分别为0.89、0.87，准确性为0.90。见图1。

表3 痴呆患者血清miR-9、miR-34c表达与HDL-C、LDL-C、ADP、Hcy、MMSE评分的相关性

3 讨论

随着人口老龄化，我国痴呆患病人数逐年升高，给家庭和社会带来极大经济负担，早期诊治是控制病情进展、改善患者预后的重要措施。痴呆发病机制复杂，涉及年龄、遗传、神经传递异常、炎症反应等多种因素[13]，给早期诊治带来巨大挑战，寻找血清学标志物辅助临床诊断成为研究热点。随着分子生物学研究的深入，研究发现，痴呆患者大脑组织和外周血中存在差异性表达的miRNA，提示其可能通过调控靶基因而介导精神分裂症的发病过程[14]。miRNA是存在于真核生物中的内源性小分子单链RNA，不编码蛋白质，在后转录水平可与靶mRNA的3′端非翻译区以碱基互补配对的方式结合，使mRNA的翻译受到抑制或使其降解，进而调控靶基因的表达[15]。miRNA不仅介导了细胞增殖、分化、生长及脂肪代谢、器官形成等生理过程，而且还与多种疾病密切相关，如作为促癌或抑癌基因参与恶性肿瘤的发生发展过程。miRNA能在组织中特异性表达且稳定性好，并且是非侵入性的血清学标志物，简单易得，成本较低，现已被推荐作为早期诊断恶性肿瘤的重要标志物[16]。

图1 血清miR-9、miR-34c诊断痴呆的ROC曲线

miR-9包括前体miR-9和成熟的miR-9，成熟的miR-9可抑制锌指蛋白521的表达而使骨髓间充质细胞分化为神经细胞，同时介导突触孔蛋白、突触小泡磷酸酶1等基因的表达,而对神经元间突触传递递质功能造成影响，并进一步影响神经元的活性。淀粉样蛋白前体(APP)以及淀粉样前体蛋白β位点裂解酶1(BACE1)通过剪切作用可形成β-淀粉样蛋白(Aβ)，而Aβ表达异常介导了神经元变性过程。研究显示[17]，miR-9在阿尔茨海默病患者大脑海马区、颞叶区等部位异常表达，通过调控APP、BACE1等的功能而对Aβ的表达产生影响，进而介导神经退行性变过程。miR-34是广泛表达于人类细胞的miRNA，已有研究证实，其参与了多种恶性肿瘤的生物学进程。miR-34包括miR-34a、miR-34b、miR-34c，各个成员功能不同，miR-34c在形成学习记忆中发挥作用，作为潜在调控因子调控认知功能。miR-34c高表达与海马记忆功能密切相关，其在海马神经元中表达上调，通过对脊柱密度、树突长度负向调节而使海马神经元树突变短，减少脊柱及丝状伪足。而树突及突触作为记忆形成及存储的基本结构、信号转导的重要位点，如果受损将造成记忆功能障碍，诱发痴呆[18]。Cao等[19]研究发现，将miR-34c抑制剂注射至小鼠海马部位，可使沉默信息调节因子2相关酶1(SIRT1)表达升高，小鼠记忆能力改善，而抑制老年鼠中miR-34c表达也可使SIRT1表达恢复，由此证实miR-34c通过介导记忆形成相关基因表达而参与调控大脑记忆能力。

研究[20]证实，痴呆患者存在不同程度血脂异常，本研究也发现随着痴呆病患者情加重，HDL-C水平逐渐降低，LDL-C水平逐渐升高。可能因为血脂异常可使动脉粥样硬化加速，诱使痴呆进展，病情加重。ADP主要由脂肪细胞分泌的在人体血浆中流通的蛋白质，可介导脂类代谢，调节系统中枢炎症反应，保护血管内皮细胞功能，从而抑制痴呆进展，其水平升高可保护痴呆患者的认知功能[21]。正常生理状态下，Hcy代谢，从而其水平较低；而代谢异常时，Hcy在体内蓄积，可激活相关神经受体，释放氧自由基，增加钙离子浓度，导致神经细胞中毒发生凋亡。研究显示，Hcy水平升高2倍是痴呆发生的独立危险因素，降低Hcy水平可帮助延缓痴呆的进展，改善预后[22]。MMSE是痴呆筛查的主要量表之一，可迅速、准确、灵敏地反映研究对象认知功能缺损程度及智力状态。本研究结果提示，痴呆患者存在不同程度的认知功能障碍及智力缺损。与对照组比较，痴呆患者HDL-C、ADP水平及MMSE评分低，LDL-C、Hcy水平高；并且随着痴呆病情加重，差异更为显著。此外，痴呆患者血清miR-9表达低于对照组，血清miR-34c表达高于对照组。提示miR-9、miR-34c可能参与痴呆的发生发展过程，与有关研究[16]结果相似。可能与miR-9具有抑制神经元分化的功能有关，miR-9表达下降，加速神经元分化而进展为痴呆；miR-34c表达升高可负向调节树突并使其受损，进而诱发痴呆。随着痴呆病情的加重，血清miR-9表达下调更为明显，miR-34c表达上调也更加显著。提示两者异常表达可作为临床辅助评估痴呆病情严重程度的标记物，为临床制订治疗方案提供指导。

本研究相关分析结果显示，痴呆患者血清miR-9与HDL-C、ADP、MMSE评分呈正相关性，与LDL-C、Hcy呈负相关性；血清miR-9与HDL-C、ADP、MMSE评分呈负相关性，与LDL-C、Hcy呈正相关性。提示miR-9、miR-34c可能通过介导血脂异常过程而参与痴呆发病，同时其与MMSE评分相关又可作为评估痴呆病情严重程度的重要指标。绘制ROC曲线进一步分析显示，血清miR-9和miR-34c可作为早期诊断痴呆的重要标志物，并且二者联合检测的诊断价值更高。提示联合检测血清miR-9、miR-34c，有助于早期诊断痴呆，从而为临床及时制订针对性干预方案、改善患者预后提供指导。

综上所述，miR-9、miR-34c参与了痴呆的发病过程，并且与病情严重程度密切相关，早期联合检测可辅助诊断痴呆。本研究为回顾性分析，可为痴呆的病因学探讨提供线索，下一步将开展前瞻性队列研究，以进一步探讨上述指标在痴呆发病过程中的作用。