郭生龙,李鹏,雷琦
(陕西省人民医院 神经内科,陕西 西安 710068)
脑梗死是临床常见的脑血管疾病,是由多种原因导致的局部脑组织区域发生血液供应障碍,引起脑组织缺血、缺氧性病变,从而产生的一系列临床症状,是一种具有极高病死率和致残率的疾病[1]。动脉硬化被认为是导致脑梗死的重要因素之一,而甘油三酯(Triglycerides,TG)的升高已经证实是导致动脉粥样硬化发生的独立危险因素[2]。随着研究进一步深入,载脂蛋白A5(ApoA5)与动脉硬化被认为具有一定的关系,本研究观察陕西省人民医院脑梗死患者的动脉粥样硬化程度和ApoA5-1131T/C、553G/T 2 个位点的关系,现报道如下。
随机选取2015年1月—2017年1月陕西省人民医院脑梗死患者120 例进行临床研究。所有患者符合全国第4 届脑血管病学术会议制定的诊断标准,并经头CT 和颈部超声确定诊断。其中,男性77 例,女性43 例;年龄58~79 岁,平均(72.33±5.14)岁。研究经本院医学伦理委员会批准。
纳入标准[3]:①病程为72 h 内;②病变部位仅限于颈内动脉供血区域;③既往无中风病史;④患者或者患者家属对本研究知情同意。排除标准[4]:①合并其 他系统、器官、部位炎症病变的患者;②既往有脑出血或者脑梗死病史的患者;③合并冠状动脉粥样硬化性心脏病、心房颤动、心肌梗死、肝肾衰竭的患者;④合并大动脉炎等动脉系统疾病的患者;⑤来诊前1个月内有炎症抑制药物或者免疫抑制剂应用史患者;⑥有自身免疫系统疾病病史的患者。
1.3.1 颈动脉超声检查 所有患者给予颈动脉血管超声检查。患者取仰卧位、颈部充分暴露,常规检查患者的双侧颈总动脉、颈动脉分叉部、颈内动脉、颈外动脉。扫查血管壁、血管斑块形成的数量、大小、性质、血管狭窄程度。测量颈总动脉内膜-中层厚度(common carotid artery intima-media thickness,CCA-IMT)和 颈内动脉内膜-中膜厚度(internal carotid artery intimamedia thickness,ICA-IMT)。
1.3.2 基因DNA 提取 使用EDTA-K2 抗凝试管取患者静脉血1 ml,提取基因组DNA,置入-20℃冰箱冷冻保存备用。
1.3.3 聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP) Trizol 购自美国Gibco BRL 公司,Taq酶购自大连宝生物公司,模板RNA 2 μg、M-MLV 逆转录酶购自美国Promega 公司,引物由上海生工生物工程有限公司合成,UVIpro 凝胶图像分析系统购自美国KODAK 公司。将标本通过Trizol 方法提取组织总RNA。PCR 反应条件:①-1131T/C 位点,96℃预变性2 min,95℃变性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸30 s,共循环30 次,72℃继续延伸5 min。②553G/T 位点,95℃预变性5 min,95℃变性30 s,65℃退火40 s,72℃延伸50 s,共循环35 个,72℃继续延伸7 min。PCR 扩增产物10LL 在-1131T/C 位点加入限制性内切酶MseI 5 u,553G/T 位点加入MspI 5 u,37℃消化4 h。PCR 反应产物经过1.5%琼脂糖凝胶电泳60 min,使用UVIpro 凝胶图像分析系统进行摄像、扫描、分析。
1.3.4 血脂相关指标检查 取患者清晨空腹静脉血3 ml,检测其TG、低密度脂蛋 白(low-density lipoprotein,LDL)、 高密度脂蛋白(high-density lipoprotein,HDL)、血清总胆固醇(total cholesterol,TC)水平。上述所有指标由本院生化实验室进行检测,仪器为7060 全自动血生化仪(日本日立公司),严格按照仪器说明书要求进行操作。
观察-1131T/C 位点和553G/T 位点间的CCA-IMT和ICA-IMT 间的差异,观察-1131T/C 位点和553G/T 位点不同基因型的TC、TG、HDL-C、LDL-C 水平。比较常见单倍型配对间的CCA-IMT 和ICA-IMT 水平。
数据分析采用SPSS 19.0 统计软件。计量资料以均数±标准差(±s)表示,比较采用t检验或方差分析,P<0.05 为差异有统计学意义。
-1131T/C 位点基因型为CC 的患者与基因型为TT+TC 的患者CCA-IMT 比较,差异无统计学意义(P> 0.05);-1131T/C 位点基因型为CC 的患者与基因型为TT+TC 的患者ICA-IMT 比较,差异有统计学意义(P< 0.05),CC 基因型的ICA-IMT 高于TT+TC 基因型。见表1。
553G/T 位点基因型为GG 与TT+GT 基因型的CCA-IMT 和ICA-IMT 比较,差异均无统计学意义(P> 0.05)。见表2。
表1 -1131T/C 基因型脑梗死患者的CCA-IMT 和ICA-IMT 比较(mm,±s)
表1 -1131T/C 基因型脑梗死患者的CCA-IMT 和ICA-IMT 比较(mm,±s)
基因型 n CCA-IMT ICA-IMT CC 13 1.10±0.27 1.06±0.13 TT+TC 107 1.06±0.33 0.91±0.14 t 值 0.420 3.678 P 值 0.675 0.000
表2 553G/T 基因型脑梗死患者的CCA-IMT 和ICA-IMT 比较(mm,±s)
表2 553G/T 基因型脑梗死患者的CCA-IMT 和ICA-IMT 比较(mm,±s)
基因型 n CCA-IMT ICA-IMT GG 102 1.09±0.22 0.95±0.14 TT+GT 18 1.12±0.27 1.01±0.18 t 值 0.515 1.603 P 值 0.608 0.112
-1131T/C位点基因型CC与TT+TC位点患者TC、HDL-C、LDL-C 水平比较,差异无统计学意义(P> 0.05),-1131T/C 位点基因型CC 与TT+TC 位点TG 水平比较,差异有统计学意义(P<0.05),CC 位点TG水平高于TT+TC 水平。见表3。
553G/T 位点基因型GG 与TT+GT 位点患者TC、TG、HDL-C 及LDL-C 水平比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。见表4。
TG-TG、TG-CG、TG-CT、CG-CG 的CCA-IMT水平比较,差异无统计学意义(P>0.05),而ICA-IMT水平比较差异有统计学意义(P<0.05),其中CG-CG型最高,TG-CG 型最低。见表5。
表3 -1131T/C 位点不同基因型患者的血脂水平比较(mmol/L,±s)
表3 -1131T/C 位点不同基因型患者的血脂水平比较(mmol/L,±s)
基因型 n TC TG HDL-C LDL-C CC 13 4.15±0.22 2.20±0.19 1.07±0.18 2.25±0.15 TT+TC 107 4.20±0.18 1.77±0.23 1.04±0.13 2.27±0.12 t 值 0.923 6.471 0.751 0.552 P 值 0.358 0.000 0.454 0.582
表4 553G/T 位点不同基因型患者的血脂水平比较(mmol/L,±s)
表4 553G/T 位点不同基因型患者的血脂水平比较(mmol/L,±s)
基因型 n TC TG HDL-C LDL-C GG 102 4.13±0.15 1.71±0.25 1.15±0.06 2.47±0.18 TT+GT 18 4.20±0.20 1.59±0.62 1.12±0.12 2.42±0.16 t 值 1.731 1.432 1.634 1.103 P 值 0.086 0.158 0.105 0.272
表5 常见单倍型配对间的CCA-IMT 和ICA-IMT 水平比较(mm,±s)
表5 常见单倍型配对间的CCA-IMT 和ICA-IMT 水平比较(mm,±s)
单倍型配对 n CCA-IMT ICA-IMT TG-TG 52 1.03±0.18 0.99±0.13 TG-CG 41 1.02±0.04 0.96±0.18 TG-CT 10 1.04±0.10 1.07±0.10 CG-CG 17 1.08±0.08 1.14±0.06 F 值 1.106 3.447 P 值 0.092 0.018
载脂蛋白是血浆脂蛋白中的蛋白质部分,其作用是遇血脂结合并运输到机体各个组织中进行代谢,以及进行蛋白质利用[5]。大量研究发现载脂蛋白基因发生突变,形成不同等位基因多态性,而不同表型的载脂蛋白对血脂的代谢和利用会发生不同影响,进而对机体产生影响,对患者高脂血症、动脉粥样硬化、心脑血管等疾病的发生和发展起到一定作用。目前研究认为,载脂蛋白具有促进脂类运输、调节酶活性、同细胞表面结合等作用,是一组在功能上非常活跃的血浆蛋白[6-7]。
载脂蛋白主要分为A、B、C、D、E 5 个种类,在肝脏和小肠中合成。其中载脂蛋白在分子量、免疫性和代谢上均呈现出多态性,在HDL 中含量最多,是构成血浆HDL 的重要组成部分,具有清除组织脂质和抗动脉粥样硬化的作用[8-9]。
ApoA5 是载脂蛋白超家族的新成员,是在2001年由2 个不同的研究小组先后于载脂蛋白A1、载脂蛋白C3、载脂蛋白A4 的基因簇中所鉴定出来,而且研究发现人类的载脂蛋白A5 的基因与小鼠的载脂蛋白A5 基因的同源性能够达到71%,但是与人类载脂蛋白A4 的基因同源性仅为27%[10]。在后续的研究中发现,尽管其浓度较低,但是对降低血浆TG 具有重要意义,同时研究发现与肥胖和代谢综合征的发生、发展具有密切关系[11]。人类的ApoA5 是由343 个氨基酸残基所组成,结构中具有多个双性的A-螺旋结构,同时也包含有B 折叠和B 转角结构[12]。A-螺旋结构是ApoA5 的活性中心,在疏水性和长度上出现非常大的差异性,使用双抗夹心酶联免疫吸附试验检测后发现ApoA5 在极LDL、HDL、乳糜微粒中均有存在,因此被认为在调节富含TG 脂蛋白代谢过程中具有重要作用,并认为可能存在一个机制,使其循环再利用,从而弥补ApoA5 在外周循环中出现的含量不足的问题[13]。
-1131T/C 位点和553G/T 位点被认识是影响ICA- IMT 厚度变化的基因型,这一机制可能与-1131CC 基因型具有诱导颈内动脉内膜变厚的作用,553GG 基因对CCA-IMT 具有一定影响,这一机制可能与患者基因表达蛋白质不同有所关联。-1131CC 基因型所表达的蛋白质具有血脂在颈内动脉的内膜中沉积的作用,而553TT+GT 基因型所表达出的蛋白具有促进血脂在颈总动脉沉积的作用[14-15]。如果能确定不同基因在人体血脂沉积过程中起到的作用,也就为动脉粥样硬化的基因治疗提供了新的思路。
从本研究来看,-1131T/C 位点基因型中CC 与TT+TC 基因型的CCA-IMT 无差异,-1131T/C 位点基因型中CC 与TT+TC 基因型的ICA-IMT 有差异,CC的ICA-IMT 高于TT+TC,说明-1131CC 具有促使ICA-IMT 增厚的作用,该作用可能通过诱导血脂在颈内动脉内膜中沉积的作用。而553G/T 位点基因型中GG 与TT+GT 基因型的CCA-IMT 与ICA-IMT 无差异,说明553G/T 位点基因型对CCA-IMT、ICA-IMT 的厚度增加并无明显作用。-1131T/C 位点基因型CC 与TT+TC 位点TC、HDL-C、LDL-C 水平无差异,但CC位点TG 水平高于TT+TC 水平有差异,说明-1131T/C 位点基因型CC 对TC、HDL-C、LDL-C 水平无影响,但能够影响TG 水平的升高,这也与-1131CC 具有促使ICA-IMT 增厚的作用相符合。而553G/T 位点基因型GG 与TT+GT 位点患者TC、TG、HDL-C、LDL-C 水平无差异,说明553G/T 位点基因型未改变CCA-IMT、ICA-IMT 的厚度的作用。在常见单倍型配对间的CCAIMT 和ICA-IMT 水平影响中,TG-TG、TG-CG、TGCT、CG-CG 的CCA-IMT 无差异,而ICA-IMT 水平有差异,其中CG-CG 型最高,TG-CG 型最低。说明不同的单倍型配对会影响ICA-IMT 厚度,这也成为促使动脉粥样硬化发展的重要因素。
综上所述,载脂蛋白A5 基因-1131T/C 和553G/T 两个位点与脑梗死患者的动脉硬化程度联系紧密,能够促使血脂在颈动脉和颈内动脉中发生沉积,从而诱导动脉硬化发生、发展,因此对基因的研究有可能为动脉硬化的预防与治疗提供新的思路,值得进一步深入研究,而ApoA5 作为新发现的载脂蛋白超家族的成员,仍然有大量的研究工作需要进行,以便观察其在脑梗死患者动脉粥样硬化发生、发展过程中的作用。