脓毒症患者T淋巴细胞亚群变化及与炎症状态的关系研究

叶瑞，胡炜，刘炳炜，席绍松，朱英，未亚平

（1.浙江中医药大学，浙江 杭州，310053；2.浙江大学医学院附属杭州市第一人民医院 重症监护室，浙江 杭州，310006）

脓毒症是由于感染的宿主反应失控诱发致命性器官功能障碍，是导致重症监护室（ICU）患者死亡的主要病因，病死率＞40%[1]。脓毒症的发病机制较为复杂，目前普遍认为与全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome,SIRS）/ 代偿性抗炎反应综合征（compensatory antiinflammatory response syndrome,CARS）及免疫失衡有关[2]。脓毒症作为一种炎症应激性疾病，促炎/抗炎反应异常参与其病理生理进程，这也是诱发、增强及放大疾病病理生理变化进程的关键，同时也将影响机体免疫平衡[3]。T 淋巴细胞参与机体免疫调节、免疫应答、全身炎症反应等过程，在免疫稳态和SIRS/CARS 的维持中具有重要作用[4]。目前，关于脓毒症患者病情变化过程中T 淋巴细胞亚群及炎症因子的变化特点尚未完全阐明，两者间的具体关系及对预后的影响仍不明确。本研究动态监测了脓毒症患者的T 淋巴细胞亚群及血清炎症因子水平变化，并分析两者之间的关系，旨在探讨免疫紊乱及炎症反应在脓毒症发生、发展过程中的演变规律，为临床干预治疗提供参考，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年3月—2018年10月浙江大学医学院附属杭州市第一人民医院ICU 收治的脓毒症患者126 例作为观察组，根据病情程度分为脓毒症组、严重脓毒症组与脓毒症休克组，并根据随访28 d 生存情况分为存活组与死亡组。纳入标准：①符合2016年脓毒症国际会议诊断标准[5]；②发病24 h 内入院；③年龄＞18 岁；④首次入住ICU。排除标准：①既往存在心、脑、肝、肺、肾等重要脏器功能不全或严重原发病者；②具有恶性肿瘤、变态反应性疾病、免疫缺陷型疾病、自身免疫性疾病者、再生障碍性贫血病史者；③近6 个月内接受放疗、化疗、激素或免疫抑制剂治疗者；④入住ICU 病房后24 h 内临床检测指标不全者；⑤入住ICU 病房时即出现呼吸停止或心跳停止者；⑥入住ICU 病房24 h 内死亡者；⑦处于妊娠期或哺乳期女性。另选同期健康体检，且性别、年龄相匹配的志愿者60 例作为对照组。研究设计获本院医学伦理委员会审核批准，所有受试对象知情并签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 资料收集 患者在入住ICU 病房24 h 内完成基本资料收集，包括年龄、性别、细菌培养情况、感染部位等。检测外周血T 淋巴细胞亚群（CD4+、CD8+、CD4+/CD8+）和炎症因子[ 白细胞介素-6（Interleukin-6,IL-6）、白细胞介素-10（Interleukin-10,IL-10）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α,TNF-α）、高迁移率族蛋白B1（high mobility group box protein-1,HMGB-1）]。

1.2.2 检测方法 脓毒症患者分别在就诊时、住院6 h，以及第1、3 和7 天采集外周血，对照组均在体检当天采血，均采集晨间空腹静脉血6 ml，分为2 份，一份于4℃下以1 000 r/min 离心10 min，留取血清标本于EP管中置入-80℃冰箱冷冻保存待测，采用潘氏法测定血沉（erythrocyte sedimentation rate,ESR），采用双抗夹心免疫发光法测定降钙素原（Procalcitonin,PCT），采用散射免疫比浊法检测C 反应蛋白（C-reactive protein，CRP），采用酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测血清IL-6、IL-8、IL-10 及TNF-α，ELISA 试剂盒购自美国 Beckman 公司；另一份分离单个核细胞，采用美国Biolegend 公司生产的流式细胞仪检测T 淋巴细胞亚群（CD4+、CD8+、CD4+/CD8+）。操作严格按试剂说明书及实验室规程执行。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较采用t检验、单因素方差分析及重复测量设计的方差分析，计数资料以例（%）表示，比较采用χ2检验和确切概率法（Monte Carlo 法），相关性分析用Pearson 相关性检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料

观察组126 例患者中，男性75 例（59.52%），女性51 例（40.48%）；年龄45～85 岁，平均（60.23± 10.44）岁；严重程度：63 例脓毒症，39 例严重脓毒症，24 例脓毒性休克；感染部位：68 例（53.97%）肺部感染，34 例（26.98%）腹腔感染（胆管炎、腹膜炎），19 例（15.08%）尿路感染，5 例（3.97%）其他（胃肠道感染、中枢神经系统感染）（见表1）。观察组与对照组的年龄、性别比较，差异无统计学意义（年龄：t=0.753，P =0.452；性别：χ2=0.257，P =0.612）。观察组不同严重程度脓毒症患者的年龄、性别、细菌培养阳性及感染部位比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 入院时观察组与对照组T 淋巴细胞比较

入院时，观察组的CD4+、CD8+、CD4+/CD8+与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），观察组CD8+较对照组升高，而CD4+、CD4+/CD8+较对照组降低。见表2。

2.3 入院时观察组与对照组血清炎症因子比较

入院时，观察组的ESR、PCT、CRP、IL-6、TNF-α、IL-10、HMGB-1 与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），观察组较对照组升高。见表3。

表1 不同严重程度脓毒症患者一般资料的比较

表2 两组T 淋巴细胞比较（±s）

表2 两组T 淋巴细胞比较（±s）

组别 n CD4+/% CD8+/% CD4+/CD8+对照组 60 46.12±3.31 26.22±2.41 1.76±0.23观察组 126 35.21±2.64 29.13±3.34 1.21±0.15 t 值 24.219 6.038 19.526 P 值 0.000 0.000 0.000

2.4 不同程度脓毒症患者T 淋巴细胞动态变化

不同程度脓毒症不同时间点CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比较，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不 同时间点的CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比较，差异有统 计学意义（F=13.312、6.711 和10.259，P=0.000、0.033 和0.012）；②组间CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比较，差异 均有统计学意义（F=15.694、9.213 和12.206，P=0.000、0.011 和0.000）；③组间CD4+、CD8+、CD4+/CD8+变化 趋势差异均有统计学意义（F=16.031、10.415 和14.612，P=0.000、0.008 和0.000）。见表4。

2.5 不同程度脓毒症患者血清炎症因子动态变化

不同程度脓毒症患者不同时间点ESR、PCT、CRP、IL-6、IL-10、TNF-α、HMGB-1 比较，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点的PCT、CRP、IL-6、IL-10、TNF-α 差异均有统计学意 义（F=6.779、22.165、16.731、9.182 和6.637，P= 0.032、0.000、0.000、0.0016 和0.033），而HMGB-1 水平仅在入院7 d 时呈升高趋势（F=6.173，P =0.041），在其余各时间点无差异（P＞0.05）；②组间PCT、CRP、IL-6、Il-10、TNF-α 比较，差异有统计学意义（F= 7.012、18.312、14.011、8.231 和5.967，P=0.028、0.000、0.000、0.019 和0.041），但不同亚组间ESR 仅在入院第3 和7天时有差异（F=6.741 和6.717，P=0.036和0.039），HMGB-1 水平仅在入院第7 天时有差异（F=5.796，P =0.044）；③组间ESR、PCT、CRP、IL-6、IL-10、TNF-α、HMGB-1 变化趋势比较，差异有统计学意义（F=6.512、0.781、23.451、18.226、11.403、7.719 和8.831，P=0.036、0.028、0.000、0.000、0.000、0.027 和0.016）。见表5。

表3 入院时两组血清炎症因子比较（±s）

表3 入院时两组血清炎症因子比较（±s）

组别 n ESR/（mm/h） PCT/（ng/ml） CRP/（mg/L） IL-6/（pg/ml） TNF-α/（pg/ml） IL-10/（pg/ml） HMGB-1/（pg/ml）对照组 60 18.43±3.96 0.48±0.15 3.78±1.02 17.12±6.14 13.85±3.43 8.26±2.31 42.21±5.96观察组 126 30.32±9.31 5.56±1.19 72.01±10.45 60.94±15.21 37.21±9.95 45.83±11.26 62.02±18.31 t 值 9.482 6.994 50.390 21.474 17.671 25.556 8.167 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

表4 不同程度脓毒症患者T 淋巴细胞动态变化（±s）

表4 不同程度脓毒症患者T 淋巴细胞动态变化（±s）

注：①与严重脓毒症组比较，P ＜0.05；②与脓毒性休克组比较，P ＜0.05。

组别 n 入院时 6 h 1 d 3 d 7 d CD4+/% 脓毒症组 63 41.01±3.95① 36.85±2.71① 23.14±3.11① 26.82±3.31① 30.34±3.65① 严重脓毒症组 39 36.36±2.88①② 30.22±2.85①② 20.69±2.62①② 21.85±3.11①② 24.59±4.12①② 脓毒性休克组 24 31.35±2.71 27.74±2.11 17.23±1.65 18.33±2.15 20.33±3.01 CD8+/% 脓毒症组 63 31.25±2.67① 28.96±3.41① 25.11±2.41① 26.72±3.41① 28.85±3.62① 严重脓毒症组 39 32.88±3.14 30.01±2.72 22.61±2.65 25.23±3.36 27.17±3.32 脓毒性休克组 24 33.35±3.41 31.45±2.83 21.56±2.79 23.45±3.12 25.04±3.23 CD4+/CD8+ 脓毒症组 63 1.31±0.19① 1.27±0.18① 0.92±0.16① 1.00±0.17① 1.05±0.18① 严重脓毒症组 39 1.10±0.16①② 1.01±0.14①② 0.91±0.15①② 0.87±0.16①② 0.90±0.19①② 脓毒性休克组 24 0.94±0.11 0.88±0.10 0.80±0.10 0.78±0.15 0.81±0.17

2.6 外周血T 淋巴细胞亚群与炎症因子的相关性

Pearson 相关性分析显示，脓毒症患者的CD4+、CD8+、CD4+/CD8+与ESR 的相关性差异无统计学意义（P＞0.05），但与血清PCT、CRP、IL-6、IL-10、TNF-α 和HMGB-1 均呈线性相关（P＜0.05）。见表6。

表5 不同程度脓毒症患者血清炎症因子动态变化（±s）

表5 不同程度脓毒症患者血清炎症因子动态变化（±s）

组别 n 入院时 6 h 1 d 3 d 7 d ESR/（mm/h） 脓毒症组 63 28.81±8.23 30.21±9.69 32.14±10.68 36.81±12.24 25.12±10.44 严重脓毒症组 39 32.12±11.85 33.35±12.82 36.64±12.32 44.02±14.21① 33.69±16.55① 脓毒性休克组 24 34.09±13.95 35.14±13.94 39.01±15.83① 50.32±16.94①② 46.24±18.47①②

续表5

表6 外周血T 淋巴细胞亚群与炎症因子的相关性

3 讨论

脓毒症患者的免疫失调机制尚未完全阐明，主要认为炎症细胞因子的系统性释放诱发SIRS 的发生，而炎症因子风暴被认为是脓毒症发生发展及预后不良的关键机制[6]。TNF-α 是一种由活化巨噬细胞等分泌的小分子蛋白，过度表达时可激活炎症级联反应，促进IL-6 等炎症介质的合成与释放，导致炎症反应失控。动物研究表明，脓毒症大鼠呈现明显的TNF-α 过度表达，且以脓毒性休克大鼠水平最高，在受到攻击后1 h 即有明显升高并持续至24 h[7]。IL-6是一种二级炎症反应介质，对炎症细胞及血管内皮细胞具有直接激活和毒性作用，且可诱导各类急性时相蛋白的生成，促进和放大炎症反应，已有研究证实其与SIRS 严重程度及其致死率密切相关[8]。因IL-6 在循环中代谢清除速度较为缓慢容易检测，故被视为脓毒症病情严重程度的重要指标。ESR、PCT 和CRP 是临床监测急性感染的常用指标，其中ESR 的敏感性较高但特异性较低，不适用于疾病诊断，而PCT 及CRP被证实与脓毒症的病情及预后密切相关。CRP 在感染4～6 h 即可急剧升高，2 d 左右即可达峰值，且随着病情好转可迅速降低；PCT 作为一种刺激炎症因子，其本身无法启动脓毒症的发生，但可在IL-6、TNF-α等诱导下大量生成，可扩大和加重脓毒症的病理生理进程，也是感染的早期敏感标志物之一[9]。HMGB-1是新近发现的晚期炎症细胞因子，在受到炎症等攻击后约9～16 h 分泌，约24 h 后达峰值，其生成晚于IL-6、TNF-α 等早期炎症因子但持续时间较长，可由IL-1β 或TNF-α 等刺激单核/巨噬细胞分泌，也可由坏死细胞释放并转移至细胞外。HMGB-1 高表达又可导致巨噬细胞进一步活化，促进IL-6、TNF-α等细胞因子的释放[10]。部分研究证实，HMGB-1 过度表达与病死率密切相关，如杨婉等[11]研究显示，入院时HMGB-1 高水平脓毒症休克（＞35 pg/ml）患者在7 d 后APACHE Ⅱ评分低于低水平者（≤35 pg/ml），且3 个月内存活率明显降低（44.4% VS 80.00%）。提示HMGB-1 高表达将增加脓毒症的病情严重程度及治疗难度，影响临床预后。本研究结果显示，脓毒症患者入院时血清ESR、PCT、CRP、IL-6、TNF-α 及HMGB-1 水平均高于对照组，且严重脓毒症、脓毒性休克者的血清IL-6、TNF-α 进一步升高，提示脓毒症患者的病情越重，其促炎细胞因子水平越高。动态观察各组的血清炎症细胞因子水平变化显示，IL-6 及TNF-α 水平的峰值出现在入院后6 h，此后逐步下降，与温前宽等[12]报道基本一致。HMGB-1 则在入院24 h 后达峰值并持续72 h，此后有所下降但仍维持较高水平。可见与其他早期炎症因子比较，脓毒症患者的HMGB-1 变化相对较晚但持续时间更长，可能与脓毒症的晚期炎症损伤有关。上述研究结果可见，持续性、压倒性SIRS 可能是导致病情进展或最终发展为脓毒性休克的主要原因。但研究结果亦显示，经过治疗7 d 后，血ESR、PCT、CRP、IL-6、TNF-α、HMGB-1 水平仍高于对照组，推测SIRS 并非脓毒症的唯一原因，故引出CARS 的概念。

既往观点认为，抗炎因子的升高是有利于防控炎症反应的损伤，但近年来研究显示，过度抗炎作用也将诱发免疫失衡，抗炎反应与促炎反应通常相伴发生。动物研究显示，脓毒症死亡动物模型的抗炎因子IL-10 峰值出现时间较促炎因子TNF-α 更早[13]；还有临床研究显示，随访28 d 内死亡脓毒症患者的早期血清IL-10 水平升高且高于脓毒症患者，且随着病情进展IL-10 有持续升高趋势[14]。由此可见，脓毒症患者的早期免疫抑制状态可能较SIRS 发生更早，且在脓毒症发生及发展过程中抗炎反应持续存在。岳茂兴等[15]研究则显示，创伤性脓毒症患者的血清IL-6、IL-10 及TNF-α 等细胞因子水平均在确诊后第1 天即有明显升高，且在第3 天达峰值，这与本研究结果略有差异，可能与患者入院前病程长短及病情严重程度不一有关。总体而言，认为在脓毒症发病初期即有大量促炎细胞因子如IL-6、TNF-α 等释放而诱发SIRS，同时伴有抗炎细胞因子如IL-10 等生成引起CARS，两者之间呈现动态变化。在入院治疗7 d 后，各组的ESR、PCT、CRP、IL-6、IL-10、TNF-α 及HMGB-1 水平虽有不同程度的下降，但仍未恢复正常，尤其是脓毒性休克组的各指标水平仍处于较高水平，认为炎症反应并非影响患者病情变化的唯一因素。

临床研究显示，相比于早期炎症反应而言，超过80%的脓毒症患者死于免疫抑制状态下的感染，故免疫抑制可能是导致患者预后不良的关键因素[16]。关于炎症细胞因子尤其是IL-10 等抗炎细胞因子对脓毒症患者免疫功能及临床预后的影响目前尚无定论，大部分研究认为IL-10 能够抑制IL-6、TNF-α 促炎细胞因子的过度表达。新近研究发现，过度促炎反应可导致机体免疫损伤加重；同时，过度抗炎反应也可引起免疫功能紊乱，削弱机体对致病菌的杀伤或清除能力，重则诱发免疫麻痹状态，增加继发性感染风险[17]。T淋巴细胞是机体是影响免疫应答的关键细胞，T 淋巴细胞功能及数量紊乱在脓毒症发生及发展过程中具有核心作用，其中CD4+T 淋巴细胞主要发挥协助体液和细胞免疫的作用，CD8+T 淋巴细胞则主要发挥抑制和杀伤作用，可诱导和维持免疫耐受。因此，CD4+/CD8+比值能够较好地预估机体免疫状态，CD4+细胞无反应或反应性降低均可导致其对CD8+细胞的辅助能力减弱，进而导致细胞的杀伤、溶解功能降低，即免疫应答的负调节占据相对优势[18]。本研究结果显示，脓毒症患者在入院初期即存在明显的T 淋巴细胞亚群失衡，抑制性T 细胞比例升高而辅助性T 细胞比例下降，表现为CD4+/CD8+比值明显降低，提示脓毒症患者在早期即存在明显的机体免疫抑制。进一步监测不同时间点T 淋巴细胞亚群变化显示，各组CD4+、CD8+在入院第1 天时达到谷值，此后逐步升高，但CD4+/CD8+在入院第3 天时仍持续下降，第7 天时方有所回升，且仍处于较低水平，尤其是脓毒性休克组的CD4+、CD4+/CD8+低于正常范围。由此可见，脓毒症发展后期仍具有明显的免疫抑制，这可能也是影响临床预后的重要因素。进一步Pearson 相关性分析显示，观察组患者的CD4+、CD4+/CD8+与血清PCT、CRP、IL-6、IL-10、TNF-α 和HMGB-1 均呈负相关，与CD8+呈正相关，与文献报道[19-20]基本相符。表明脓毒症患者存在明显的免疫-炎症调节功能紊乱，且两者之间相互影响而导致病情加重。但本研究未见T 淋巴细胞亚群与ESR 的明显相关性，可能与ESR 在脓毒症瀑布中的效应不明确有关。

综上所述，脓毒症患者存在明显的免疫功能紊乱及促炎/抗炎细胞因子失衡，且两者间相互作用进一步影响患者的病情，加强对T 淋巴细胞亚群及炎症细胞因子的动态监测对脓毒症的临床诊疗及预后评估具有一定的指导意义。但不同炎症介质的变化时间特性存在一定的差异，且其在脓毒症发生、发展过程中的作用机制仍需进一步研究。