离心对不同层次脂肪移植成活率的影响*

张腾，冯浩，蒋甜甜，张源

（1.长沙市中医医院 皮肤科，湖南 长沙 410199；2.湖南师范大学附属第一医院皮肤科，湖南 长沙 410005）

近年来自体脂肪移植已广泛用于临床，因其移植后过高的吸收率，限制其临床应用，如何提高脂肪移植后成活率成为了目前研究的热点[1-2]；目前临床公认，按Coleman 离心方法[3]提纯脂肪可最大限度提高其成活率，本研究进一步探究按Coleman 离心方法提纯后不同层次脂肪的成活率，以便进一步指导临床，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

伊红及苏木精（美国Sigma 公司），CD31 抗体（英国Abcam 公司），青-链霉素（美国Hyclone 公司），超净工作台（上海索普仪器公司），荧光显微镜（日本Olympus 公司），恒温水浴箱（上海跃进医疗器械厂），电子天平（德国Sartorius 公司），外科手术器械及外科手术台（西安宝生手术器材有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 实验动物 3月龄新西兰兔12 只、雌雄不限，体重2 500～3 000 g，购自第四军医大学实验动物中心。

1.2.2 模型复制及分组 复制新西兰兔自体脂肪移植模型（12 只）：获取新西兰兔腹股沟皮下脂肪并移植于该兔背部皮下。依次将新西兰兔固定于手术台，背部及腹股沟备皮、消毒、用耳缘静脉注射戊巴比妥钠麻醉；待麻醉生效后，将新西兰兔腹股沟皮肤剪开，分离出腹股沟脂肪，并于超净台下剪碎，剔除筋膜，然后按照Coleman 离心方法[3]提纯脂肪，脂肪离心后去掉上层油脂及下层细胞及筋膜残渣，最后将剩余的脂肪组织分为上、中、下3组；每组取1 ml 脂肪组织；依次注射于兔背部皮下；待新西兰兔苏醒后放回饲养笼。

1.2.3 计算脂肪移植后成活体积 分别于脂肪移植术后3 个月麻醉处死新西兰兔，剥离背部脂肪移植物，用排水法测量其体积。

1.2.4 HE 染色观察脂肪移植物成活质量 将所取脂肪移植物迅速置于10%甲醛中固定。24 h 常规脱水、浸蜡、包埋、切片，行苏木精-伊红染色。在10 倍镜下观察脂肪组织的囊泡、纤维化程度及其完整脂肪细胞。评价方法包含3 个参数：脂肪组织中囊泡数目、纤维化程度、完整脂肪细胞数目；每个参数分为0～6 6 个分值：0=无、1=少量、2=比中量少、3=中量、4=比中量多、5=大量。所有组织学评价均由经过培训的实验人员完成。

1.2.5 CD31 染色观察脂肪移植物血管密度 石蜡包埋移植脂肪组织，切片机切成约5 μm 厚度的组织白片用于CD31 免疫组织化学染色。经过65℃烘烤、脱蜡、水化后微波抗原修复，3%过氧化氢去内源性过氧化物酶，一抗为鼠源Anti-CD31 抗体（1 ∶100 稀释），于4℃孵育过夜后行DAB 染色，苏木精复染，中性树胶封片。在脂肪细胞周围的间质中，血管内皮细胞被标记为深棕色，并构建成官腔样结构。采用Image-Pro Plus 6 计数血管密度（条）。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组比较采用方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验；两组比较采用t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脂肪移植后成活体积的比较

脂肪移植术后3 个月，剥离移植物，采用排水法测量各组移植物成活体积（ml）。结果显示，下层移植物成活体积为（0.51±0.15）ml，上层移植物（0.32± 0.11）ml 和中层移植物（0.38±0.13）ml，3组间移植物 成活体积比较，差异有统计学意义（F=19.453，P= 0.000）；下层移植物成活体积高于上层和中层（t= 3.538 和2.269，P=0.002 和0.033）。上层和中层移植 成活体积比较，差异无统计学意义（t=1.122，P= 0.589）。见图1。

图1 3组移植物成活体积比较

2.2 各组移植物的成活质量评估

上层和中层移植物脂肪细胞形成大量囊泡并被纤维组织包裹或分隔，完整的脂肪细胞较少。采用半定量原则，结果显示：3 层移植物囊泡得分比较差异有统计学意义（P＜0.05），且下层移植物囊泡的得分低于上层和中层移植物体积（t=6.365 和4.895，均P=0.000）；而上层和中层比较，差异无统计学意义（P＞ 0.05）。3 层纤维化程度得分比较，差异有统计学意义（P＜0.05），且下层纤维化程度低于上层和中层（t= 5.357 和6.215，均P=0.000）；而上层和中层比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。3 层完整脂肪细胞数得分比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；下层完整脂肪细胞数高于上层和中层（t=5.091 和5.195，均P= 0.000）。而上层和中层完整脂肪细胞数目比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1和图2。

2.3 移植物新生血管密度评估

下层移植物新生血管密度（6.5±0.5）条，中层（3.4±0.7）条，上层（3.2±0.6）条，3组间比较差异有统计学意义（F=126.066，P=0.000），下层移植物新生血管密度高于中层及上层（t=13.79 和11.14，均P= 0.000）；上层移植物新生血管密度与中层比较，差异无统计学意义（t=0.704，P=0.490）。见图3。

表1 3 层脂肪移植物HE 染色成活质量比较（n =12，分，±s）

表1 3 层脂肪移植物HE 染色成活质量比较（n =12，分，±s）

注：†与下层比较，P ＜0.05。

组别 囊泡 纤维化 完整脂肪细胞上层 1.6±0.3† 2.1±0.5† 2.9±0.4†中层 1.5±0.4† 2.2±0.4† 2.8±0.4†下层 0.6±0.4 1.1±0.4 3.8±0.4 F 值 26.13 37.371 18.155 P 值 0.000 0.000 0.000

图2 各组脂肪成活质量比较（HE×200）

图3 各组移植物血管密度比较（免疫组织化学×200）

3 讨论

自体脂肪移植手术术后早期填充效果较好，随着时间的推移，移植后脂肪组织逐渐被吸收，导致填充体积及质量减少，影响术后效果，严重妨碍自体脂肪移植进一步临床应用，曾一度被传统的生物填充材料所取代[4-5]。随着脂肪抽吸术及Coleman 技术的兴起[6]，自体脂肪移植成活率及脂肪组织成活质量较以前均有明显改善。目前整形外科医师按Coleman 技术离心提纯脂肪后就直接用于脂肪移植，并未对Coleman 方法提纯后的进一步量化；本研究的目的就是进一步探究Coleman 方法离心后的不同层次的脂肪移植后成活情况，更好地指导临床。

本研究发现，Coleman 方法离心后的下层的脂肪移植后成活体积、成活质量及新生血管密度均高于中、上层。其原因可能为以下几点：①离心后由于离心力的影响造成干细胞分布不同，既往研究已经表明脂肪干细胞能够分泌多种生长因子促进血管化，提高移植物成活率[7-9]。本研究结果与既往研究结果基本一致[10-11]，脂肪干细胞多的下层，其成活的体积，血管密度均优于中、上层；②由于离心力的影响，体积较大较重脂肪细胞可能位于上层，HE 染色结果发现上层脂肪组织中形成大量的囊泡。

虽然脂肪干细胞能够提高脂肪移植的成活质量，但是许多缺点制约其临床应用。首先：脂肪干细胞的获取及提纯过程都是在实验室完成，其过程复杂，容易形成污染；其次，脂肪干细胞回输过程中安全性还需进一步探究；本研究结果说明如果单纯移植Coleman 方法提纯的下层脂肪组织能够提高脂肪移植成活率，值得临床推广。