温阳健脑方对血管性认知障碍模型大鼠血清MDA、SOD和脑组织DA的影响*

佟丽妍 艾秀峰 史秀丽 徐焕凤

（1.浙江省杭州市中医院，浙江 杭州 310007；2.浙江中医药大学，浙江 杭州 310053；3.河北省玉田县计划生育中心医院，河北 玉田 064100；4河北省石家庄市长江心理医院，河北 石家庄050000）

血管性认知障碍（VCI）是1993年Hachinski和Bowlerl［1］提出的基于血管性痴呆的一个概念，是指由脑血管病危险因素（高血压、糖尿病、高血脂等）、明显（脑梗死和脑出血等）或不明显（白质疏松和慢性脑缺血等）的脑血管病引起的从轻度认知障碍到痴呆的一大类综合征［2］。2011年美国心脏协会/美国卒中协会（AHA/ASA）将VCI的概念变得更为宽泛：指由于脑血管及其危险因素导致的认知损害症状由轻度到重度的一系列综合征。而VCI的提出，是源于对血管性痴呆的早期防治的迫切需要。VCI在全国乃至全世界，是普遍存在的、亟待解决的重要问题，目前国内外尚无有效治疗方法。本实验通过观察温阳健脑方中药制剂对VCI模型大鼠血清丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和脑组织多巴胺（DA）的影响来探讨本方对于VCI的脑保护作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SD大鼠共46只，鼠龄3～5个月，体质量250～300 g，清洁级，许可证号：SCXK（沪）2017-0005。合格证号：032582。购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。饲养环境：温度20～25℃，相对湿度40%～70%。大鼠实验前在动物房环境中适应7 d。

1.2 试药与仪器 温阳健脑方：黄芪20 g，淫羊藿10 g，高良姜10 g，远志15 g，葛根12 g，姜黄12 g，石菖蒲12 g，当归10 g，川芎12 g。中药购自杭州市中医院中药房，浓煎100 mL，制得生药含量为2 g/mL的药液备用。大鼠血清MDA试剂盒（南京建成，cat△A003-1）；大鼠血清SOD试剂盒（南京建成，cat△A001-3）；大鼠脑组织DA试剂盒（南京建成，cat△H170）。超低温冰箱（青岛海尔，型号DW-86L388），水迷宫（淮北正华，型号ZH0065），数码相机（佳能505D），高通量组织研磨器（宁波新芝，型号SCIENTZ-48），台式低速自动平衡离心机（上海卢湘仪，型号TDZ6B-WS）。

1.3 模型制备 大鼠适应性饲养1周，造模前，用Morris水迷宫及Zea longa神经功能缺损评分法［3］评估出正常可参与实验的大鼠，剔除不合格大鼠。取40只大鼠进行造模，采用改良双侧颈总动脉结扎法（2VO法）［4］：大鼠术前12 h禁食，4 h禁水，用10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉，仰卧固定，颈前部常规消毒备皮，碘伏消毒后沿正中线切开，钝性剥离结缔组织和颈前肌群，分离双侧颈总动脉；腹腔注射硝普钠2.5 mg/kg，随即用无创微动脉夹夹闭双侧颈总动脉10 min，灌注10 min，再夹闭10 min，再通后，永久结扎右侧颈总动脉，并剪断，以永久阻断血流，逐层缝合颈部创口。在手术过程中，保持动物自主呼吸，并保持肛温（37±0.5）℃。待大鼠苏醒后依据Zea longa神经功能缺损评分标准筛选，1～4分视为造模成功。造模后3 d，每日肌注10万单位青霉素钠抗感染。造模成功SD大鼠共计30只。

1.4 分组及给药 将30只模型大鼠按照随机数字表方法分为5组，每组6只；另取6只正常SD大鼠作为空白组。1）空白组：不手术，不喂药。2）模型组：手术后仅用0.9%氯化钠注射液10 mL/kg，每日2次灌胃。3）吡拉西坦组：吡拉西坦片0.05 g/kg磨粉溶解至0.9%氯化钠注射液10 mL/kg中，每日2次灌胃。4）吡拉西坦+温阳健脑组：吡拉西坦片0.05 g/kg磨粉溶解至0.9%氯化钠注射液10 mL/kg中，与温阳健脑中药汤剂10 mL/kg，先后灌服，每日2次灌胃。5）温阳健脑低剂量组：采用温阳健脑中药汤剂，给予10 mL/kg，每日2次灌胃。6）温阳健脑高剂量组：采用温阳健脑中药汤剂，给予20 mL/kg，每日2次灌胃。

1.5 神经功能缺损评分 用药后第14日参照Zea longa评分法给予各组大鼠神经功能缺损评分。0级：无体征，记0分。Ⅰ级：动物不能完全伸直其前肢，记1分。Ⅱ级：动物一侧肢体瘫痪，有追尾现象，记2分。Ⅲ级：动物不能站立/打滚，记3分。Ⅳ级：无自发性活动，有意识障碍，记4分。

1.6 Morris水迷宫实验 用药后第14日对每组大鼠进行Morris水迷宫实验［5-6］。首先进行定位航行试验：训练前使大鼠在水池内自由游泳2 min，以熟悉环境。第1日：可视平台试验。实验前将大鼠笼放入测试房间适应至少30 min，期间避免其看到水池。实验时，轻轻抓住大鼠尾根，使其面对池壁，从离平台最远的象限入水，记录大鼠找到平台的潜伏期，时间为90 s。如果大鼠在规定时间内找到平台，让其在平台上停留5 s，如果大鼠在规定时间内未找到平台，让其在平台上停留20 s。实验结束，吹干毛发，将大鼠放回笼中饲养。第2至第5日：隐藏平台试验。训练时间共4 d，每天固定时间进行4次训练，每次90 s，每次间隔20 s（每只大鼠随机从每个象限的中点面壁式入水1次），如果90 s仍未找到站台，由操作者将大鼠引上站台休息20 s，训练后吹干毛发，将大鼠放回笼中饲养。图像采集系统及分析系统自动记录保存大鼠的运动轨迹、找到站台的潜伏期（escape latency）、游泳时间、游泳速度、游泳距离及寻找站台的搜寻策略等信息。

1.7 标本采集与检测 Morris水迷宫实验完毕，予每组大鼠断头处死，分别取血以检查血清SOD、MDA，取其脑组织，置冰盒上，于视交叉与视乳头之间冠状位处垂直切开脑组织，钝性分离出两侧海马，分别称重，按质量和体积比1∶10的比例，加入生理盐水冰浴匀浆。血液静置30 min后，和组织匀浆均在4℃，3 500 r/min条件下离心10 min，取上清液，参照生化试剂盒说明书的检测方法检测血清MDA、SOD和脑组织DA。

1.8 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件。计量资料以（）表示，进行方差分析和t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2结 果

2.1 一般情况 大鼠模型复制完成后，均出现神经功能障碍，第2日多数模型大鼠口鼻有血性分泌物，表现为毛发干枯，精神倦怠，反应迟钝，蜷缩懒动，部分左侧肢体偏瘫，并有多只死亡，解剖死亡的大鼠发现右脑水肿严重。大鼠脑水肿症状在24～72 h左右达到高峰期，随后逐渐恢复。

2.2 各组大鼠神经功能缺损评分比较 用药14 d后空白组、模型组、吡拉西坦组、吡拉西坦+温阳健脑组、温阳健脑低剂量组、温阳健脑高剂量组大鼠神经功能缺损评分分别为0分、（3.17±0.75）分、（1.83±0.75）分、（0.67±0.52）分、（1.00±0.63）分、（0.83±0.75）分。模型组、吡拉西坦组、温阳健脑低剂量组评分均显著高于空白组（P＜0.05或P＜0.01）；与模型组比较，吡拉西坦组、吡拉西坦+温阳健脑组、温阳健脑低剂量组、温阳健脑高剂量组评分均显著低于模型组（P＜0.05或P＜0.01）。

2.3 各组大鼠水迷宫隐藏平台试验第1日游泳总路程比较 见表1。用药14 d后隐藏平台试验第1日，与空白组比较，各组动物水迷宫游泳总路程及平台潜伏期均明显增加，游泳速度减慢（P＜0.05或P＜0.01）；与模型组比较，各给药组游泳总路程均减少，平台潜伏期缩短，游泳速度增快，其中以温阳健脾脑高剂量组最为显著（P＜0.05或P＜0.01）。

表1 各组大鼠水迷宫隐藏平台试验第1日结果比较（±s）

表1 各组大鼠水迷宫隐藏平台试验第1日结果比较（±s）

与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与空白组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同

组别空白组模型组吡拉西坦组吡拉西坦+温阳健脑组温阳健脑低剂量组温阳健脑高剂量组n 6 6 6 6 6 6路程（cm）360.55±188.95 1 494.38±773.26△△902.53±291.63*△△658.87±372.37**△△566.88±300.85**△518.30±139.21**△游泳速度（cm/s）21.18±2.18 15.21±3.40△△16.83±3.06*△17.55±3.98 17.88±2.60△20.37±3.04*平台潜伏期（s）53.87±13.07 80.62±17.89△72.63±15.95△52.73±24.55*78.27±20.57△55.37±15.35*

2.4 各组大鼠血清MDA、SOD和脑组织DA含量比较 见表2。与空白对照组比较，模型组血清MDA较空白对照组显著升高（P＜0.05）；模型组血清SOD及脑组织DA较空白对照组显著下降（P＜0.05或P＜0.01）。与模型组比较，各给药组血清MDA下降，其中温阳健脑高剂量组血清下降最为显著（P＜0.01）；各给药组血清SOD及脑组织DA均上升，其中温阳健脑高剂量组血清SOD上升最显著（P＜0.05或P＜0.01）。

表2 各组大鼠血清MDA、SOD和脑组织DA含量比较（±s）

表2 各组大鼠血清MDA、SOD和脑组织DA含量比较（±s）

组别空白组模型组吡拉西坦组吡拉西坦+温阳健脑组温阳健脑低剂量组温阳健脑高剂量组n 6 6 6 6 6 6 MDA（mol/mg）6.16±5.29 8.86±1.37△1.44±0.71**3.07±3.50**2.71±3.62**0.93±0.40**SOD（U/mg）503.41±131.60 310.42±102.74△398.18±147.72 413.00±144.37 390.19±81.35 451.47±96.92*DA（ng/mL）960.53±375.50 430.25±178.36△△944.93±214.01**863.08±333.70*760.18±279.27**1044.10±323.86**

3讨论

VCI患者存在包括记忆障碍在内的多认知域损害，有相关研究表明血管性病灶破坏了与记忆相关的海马-内侧颞叶-皮质下通路是导致这一损害的原因［7］。脑卒中发病次数及梗死面积，尤其发生于额叶、颞叶及丘脑等部位更易引起认知功能障碍［8］。VCI发病的重要因素之一是自由基代谢失衡所致的组织脂质过氧化损伤。MDA是脂质过氧化物的分解产物，是自由基对生物细胞膜损伤后的主要代谢产物，正常情况下体内产生的少量自由基可被抗氧化剂及时清除，维持动态平衡状态，脑缺血及再灌注时该平衡破坏，引发一系列连锁反应，导致细胞损伤。DA调节自主运动同时也作用于学习记忆相关的神经元，多巴胺神经系统与工作记忆的关系尤为密切。

中医学对VCI的定位主要集中在“神志病”范畴，其临床特点与中医之“善忘、呆证、脑髓消、文痴”相似。历代医家多以肝肾阴虚而辨之，治以滋阴补肾为主，多在中风后遗症的基础上治疗血管性痴呆，从而忽略了大部分脑缺血后神经功能缺损较轻或无的轻度认知功能障碍的患者，进而失去了治疗先机。中医药在本病治疗方面有其特定的优势，并能从轻度认知障碍开始，预防和治疗认知障碍及痴呆。

本研究结果提示温阳健脑高剂量组在降低血清MDA及升高血清SOD方面有明显优势，比温阳健脑低剂量组和温阳健脑+吡拉西坦组及单独吡拉西坦组均有明显疗效。在提高脑内DA方面，也具有明显效果，较吡拉西坦及吡拉西坦联合温阳健脑组以及单独温阳健脑低剂量组的效果均突出。

温阳健脑方重在温阳补气健脾充脑，促进周身各脏器功能的改善，从而达到对脑髓的保养及充实，预防及治疗由于气血不畅、脑髓失养所致之呆证。方中黄芪补气健脾，具有抗氧化的作用，黄芪总黄酮和总皂苷等成分具有显著的抗氧化活性［9］，能抑制自由基的产生和清除体内过剩的自由基，阻止新的自由基形成，有类似SOD的作用。淫羊藿总黄酮能显著降低糖尿病小鼠空腹血糖，使SOD活性升高、MDA含量降低［10］。高良姜醇提物能减少细胞内MDA含量，提高胞内SOD及GGSH-Px的活性，具有较好的抗氧化活性［11］，其归脾肾经，温中散寒助淫羊藿补肾而升阳。远志皂苷元能增强海马神经元抗氧化能力［12］。石菖蒲对小鼠各种记忆障碍模型均有不同程度的改善作用［13］，还可以提高脑内DA含量。葛根可以通过直接扩张脑血管、增加脑血流量，来提高脑组织和细胞的供血和供氧。葛根升阳的同时可解肌透热生津，在本方应用大量温补药物的同时，给予辛凉对冲，以防阳热过旺，蒸灼津液而伤阴。姜黄中的姜黄素被认为是一种天然的抗氧化剂，Kunwar等通过研究指出了姜黄素可直接清除体内的氧自由基，减少氧自由基的产生，起到抗氧化作用［14］。当归、川芎在众多实验中均可见到抑制血小板聚集，改善微循环的作用［14-16］。由此可见，本方对VCI的作用主要在于3个方面：一为清除体内氧自由基、抗氧化，因而可以提高SOD，降低MDA含量；二为抗血栓，预防及改善脑血管反复堵塞，从而预防痴呆加重；三为调节脑功能，改善作息节律，使其通过调节大脑作息而迅速恢复认知能力。本实验团队将进一步在此基础上深入研究温阳健脑方对大鼠认知功能的影响，以进一步明确本方剂的作用机制，并逐渐投入临床研究，以期获得更加有力的证据。