UV-C处理抑制马铃薯贮藏期发芽及相关机理研究

史 萌,许立兴,林 琼,阎瑞香,刘 斌,关文强，*

(1.天津市食品生物技术重点实验室,天津商业大学生物技术与食品科学学院,天津 300134; 2.中国农业科学院农产品加工研究所,北京 100193; 3.天津科技大学包装与印刷工程学院,天津 300222; 4.天津市制冷技术重点实验室,天津商业大学机械工程学院,天津 300134)

马铃薯又称土豆、洋芋,是继小麦、水稻、玉米之后的第四大主粮[1],因其营养丰富,粮菜兼用深受消费者及食品加工业者的喜爱[2]。但马铃薯在贮藏过程中容易发芽,发芽后的马铃薯不仅品质降低,更会产生α-茄碱等有毒物质,给消费者带来巨大安全隐患[3],因此解决马铃薯贮藏期间的发芽问题一直是研究的热点和难点。

现阶段马铃薯抑芽主要通过化学抑芽剂结合温度控制完成[4]。目前常用的氯苯胺灵(CIPC)在2.5%处理浓度时可明显抑制马铃薯块茎顶芽的生长[5],由于化学抑芽剂存在污染环境等问题,其使用逐渐受到限制[4]。适宜低温贮藏有利于抑制马铃薯发芽,4 ℃低温下贮藏120 d后马铃薯发芽数量及芽长仍无明显变化[6-7],但低温糖化会严重影响马铃薯加工色泽并增加丙烯酰胺等潜在致癌物质。外源乙烯可以通过影响马铃薯碳水化合物代谢来抑制马铃薯块茎的发芽,且乙烯用量越大,马铃薯抑芽效果越好[8-10],但使用乙烯气体对马铃薯的储存容器有很高的要求,且乙烯对马铃薯抑芽的阈值尚未明确[8]。因此,寻求天然无害的抑芽方法对马铃薯贮藏具有重要意义。

UV-C是主要的生物效应紫外线波段,能被生命体蛋白质分子吸收并破坏其核酸结构。低剂量紫外线照射易造成DNA可修复性损伤,进而引起生物体内抗性产生并增加细胞保护[11]。近年来研究表明,UV-C可控制番茄、菠菜等多种果蔬中致病微生物的生长,增加抗氧化酶的活性并延缓果蔬的劣变速度[12-15]。Ranganna等[16]研究发现UV-C可以降低马铃薯干腐病和软腐病的发病率,抑制马铃薯发芽并提高贮藏品质。然而,由于果蔬间组织结构、采后生理特性存在差异,不同UV-C处理方式对贮藏品质的影响较大[17]。目前关于UV-C照射剂量和处理方式对马铃薯贮藏中的抑芽效果及相关机理尚未见报道。本实验以“大西洋”马铃薯为实验材料,采用10 kJ/m2剂量UV-C分别在贮藏前(一次处理)、贮藏前及中期(二次处理)进行照射,研究UV-C处理对马铃薯贮藏期间的抑芽效果,并从赤霉素、茄碱等的变化角度来确定相关机理,为开发马铃薯贮藏保鲜新技术提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

“大西洋”马铃薯 天津市西青区洋裕生物技术有限公司脱毒马铃薯微型种薯繁育基地;L-苯丙氨酸 分析纯，天津江天化工技术有限公司;没食子酸 分析纯，上海科丰试剂厂;盐酸 分析纯，天津化学试剂批发公司;冰乙酸、乙酸锌 色谱纯，天津赢达稀贵化学试剂厂;1,2-二氯乙烷 色谱纯，天津津科精细化工研究所;三氟乙酸 色谱纯，天津南开允公合成技术有限公司;磷酸、硼酸、硼砂、酒石酸钾钠、亚铁氰化钾 分析纯，天津赢达稀贵化学试剂厂;聚乙烯吡咯烷酮 优级纯，美国Sigma公司;无水乙醇 分析纯，天津风帆化学世纪科技有限公司。

LC-20A高效液相色谱仪 日本岛津公司;TUBE-MILL control试管研磨机 德国IKA公司;FD8-4真空冷冻干燥机 美国西盟国际公司;Evolution 201紫外可见分光光度计 美国Thermo公司;BDS Thermo C18反相色谱柱 美国热电公司;电热恒温水浴锅HWS-24 上海一恒科学仪器有限公司;EL204电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;UVX数字照度计 美国UVP公司;UV-C处理装置 天津商业大学自制,由4根功率为40 W的紫外杀菌灯(G15T8)组成。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理 挑选大小均一、无病虫害、无腐烂的马铃薯立即运到实验室进行愈伤(16 ℃,避光条件下放置2周)。前期实验发现10 kJ/m2的UV-C处理对马铃薯发芽的抑制作用最明显,故采用10 kJ/m2剂量的UV-C(照射距离20 cm,照射强度1 mW/m2)在不同贮藏阶段对马铃薯进行正反两面分别照射,先将马铃薯平放,照射10 min后将块茎翻转180°继续照射10 min,以保证照射均匀。

一次处理:马铃薯愈伤刚结束(贮藏前),用10 kJ/m2剂量的UV-C 对马铃薯正反面分别照射,处理后每6个马铃薯为一组装入编织袋(高密度聚乙烯材料,30 mm×40 mm)中,共36组(216个),于10 ℃冷库中贮藏。

二次处理:一次照射处理的马铃薯于冷库中(10 ℃、RH=90%)贮藏45 d后到达休眠打破的关键时期,取出12组(72个)再次用10 kJ/m2剂量的UV-C对马铃薯正反面分别照射处理后装回编织袋中继续贮藏;CK:以不经UV-C处理的马铃薯为对照组。

贮藏期间每15 d测定一次发芽率、失重率、还原糖、苯丙氨酸解氨酶(PAL)及总酚含量。赤霉素和α-茄碱含量主要与发芽程度和休眠期有关,故实验时主要测定关键时期的含量变化,分别每45 d和30 d一测,每次测定进行3次重复。

1.2.2 指标测定

1.2.2.1 发芽率的测定 按芽眼数进行计算。

式(1)

1.2.2.2 失重率的测定 采用差量法进行测定[18]。

式(2)

1.2.2.3 还原糖含量测定 采用3,5-二硝基水杨酸比色法[19]。称取烘干(85 ℃,48 h)后的马铃薯肉质部分粉末1.00 g(相当于鲜样3.70 g)置于三角瓶中,加入25 mL蒸馏水,混匀后于50 ℃恒温水浴中保温20 min,不断搅拌使还原糖浸出,以10000 r/min离心10 min,取2 mL上清液进行还原糖含量的测定。

式(3)

式中:C为还原糖含量(mg/mL);V为还原糖提取液总体积(mL);m为样品重量(g);1000为换算系数。

1.2.2.4 总酚含量的测定 采用Wu等[20]的方法。称取马铃薯鲜样20 g,加入40 mL 70%乙醇匀浆后在60 ℃下超声20 min,并于12000 r/min离心15 min,取上清液0.5 mL与1 mL福林酚试剂混合,然后加入3 mL 20% Na2CO3溶液并在25 ℃静置120 min。用紫外可见分光光度计在760 nm处测定吸光值,以焦性没食子酸标准曲线y=0.0098x+0.0037计算相应的总酚含量,结果表示为“mg没食子酸/g鲜重”。

1.2.2.5 苯丙氨酸解氨酶(PAL)的测定 参考Hussain[21]的方法。称取马铃薯鲜样20 g,加入80 mL含5 mmol/L的巯基乙醇-硼酸缓冲液,加入2 g聚乙烯吡咯烷酮(PVPK30),匀浆后冰浴研磨,于4 ℃、12000 r/min条件下离心15 min,上清液即为粗酶液。取0.5 mL粗酶液加入2 mL 0.1 mol/L苯丙氨酸(溶于0.1 mol/L,pH=8.8的硼酸缓冲液),混匀后开始计时,测定OD290作为初值,37 ℃恒温水浴,每10 min测定一次OD290。以提取液(巯基乙醇-硼酸缓冲液)作为空白对照,每分钟OD290值变化0.01为一个酶活单位(U)。

1.2.2.6 赤霉素(GA3)含量的测定 参照Pan X[22]的方法提取马铃薯中GA3并用外标法测定含量。称取真空冷冻干燥(-80 ℃,48 h)后的马铃薯肉质部分粉末2.00 g(相当于鲜样7.50 g),加入10 mL丙醇∶水∶浓盐酸=2∶1∶0.002 (V/V/V)的混合溶液,于4 ℃下振荡30 min,加入10 mL二氯乙烷,4 ℃下振荡30 min后于4 ℃、12000 r/min条件下离心15 min,取下清液,并向残渣中加入2 mL二氯乙烷,二次离心,合并下清液为粗提液。将粗提液真空冷冻干燥(-80 ℃,12 h)所得的残留物加入5 mL磷酸盐缓冲液(0.01 mol/L,pH=3.5)溶解,经预活化的C18柱(6 mL甲醇活化,6 mL 80%甲醇平衡)过滤,以1 mL的80%甲醇进行洗脱,并收集全部洗脱液,真空冷冻干燥后用流动相溶解残渣并定容至1 mL,溶液经0.45 μm滤膜过滤,滤液用于HPLC测定。

HPLC条件:BDS Thermo C18反相色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),柱温为30 ℃;流动相为甲醇∶水=3∶7 (V/V),流速为1.0 mL/min,进样量为20 μL,检测波长为235 nm。每45 d测定一次,每次做3个重复。

1.2.2.7α-茄碱含量的测定 按照Pias[23]的方法提取马铃薯中α-茄碱并用外标法测定其含量。称取真空冷冻干燥(-80 ℃,48 h)后的马铃薯表皮(厚度为2 mm)或马铃薯肉质部分的粉末2.70 g(相当于鲜样10.00 g),加入40 mL水∶乙酸∶亚硫酸氢钠=100∶5∶0.5 (V/V/W)的混合溶液,于室温下振荡30 min后离心(12000 r/min,15 min),取上清液10 mL,经预活化的C18柱(6 mL乙腈活化,6 mL水∶乙酸∶亚硫酸氢钠=100∶5∶0.5 (V/V/W)平衡)过滤,用5 mL15%乙腈淋洗,用乙腈:磷酸盐缓冲液(0.01 moL/L,pH=7.6)=5∶5(V/V)的混合溶液洗脱,收集4 mL洗脱液。

HPLC条件:BDS Thermo C18反相色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相为乙腈∶0.1%三氟乙酸=35∶65 (V/V);流速:0.3 mL/min;进样量:20 μL;波长:202 nm。每隔30 d分别对马铃薯表皮及肉质部分中的α-茄碱进行测定,每次做3个重复。

1.3 数据处理

利用Excel 2010和SPSS 16.0等软件对实验数据进行分析,并对实验数据进行方差分析,用Duncan多重比较分析差异的显著性(p<0.05)。

2 结果与分析

2.1 UV-C处理对马铃薯贮藏过程中发芽率的影响

马铃薯发芽后,芽的生长会大量消耗块茎中的营养物质,使其外观萎蔫,严重影响商品价值[19]。UV-C处理对马铃薯贮藏过程中发芽率的影响如表1所示。

表1 UV-C处理对马铃薯贮藏过程中发芽率的影响Table 1 Effect of UV-C treatments on germination rate of potato during storage

由表1可知,贮藏75 d时,CK组发芽率为66.67%,而UV-C一次处理及二次处理的马铃薯尚未发芽;贮藏至90 d时三组马铃薯均已发芽,其中CK组的发芽率最高,UV-C二次处理的发芽率最低且与CK组差异显著(p<0.05);贮藏至105 d时,CK组发芽率94.80%,一次处理组为83.66%,二次处理组为68.78%,各组之间差异显著(p<0.05)。可知UV-C处理可有效推迟马铃薯发芽时间,且二次处理方法对马铃薯发芽的抑制效果最好,但UV-C处理不能完全抑制马铃薯发芽。

2.2 UV-C处理对马铃薯贮藏过程中失重率的影响

随着贮藏时间的延长,马铃薯受到自身呼吸作用及环境湿度的影响,使其重量不断损失,失重率逐渐升高[24]。UV-C处理对马铃薯贮藏过程中失重率的影响见图1。

图1 UV-C处理对马铃薯贮藏过程中失重率的影响Fig.1 Effect of UV-C treatments on weight loss of potato during storage注:小写字母不同表示不同处理间差异显著(p<0.05)。

由图1可知,在贮藏15～45 d期间(图1a),CK组马铃薯的失重率远高于UV-C一次处理组,但存在差异并不显著的情况(p>0.05)。贮藏至45 d时,CK组与一次处理组的失重率分别为2.52%及2.38%。贮藏60～105 d期间(图1b),二次处理组的马铃薯失重率均高于一次处理组,可能是因为低剂量的UV-C处理可以在一定程度上降低马铃薯的呼吸速率,二次处理会使马铃薯表皮组织受到轻微损伤,加速水分蒸发[25]。失重率在整个贮藏期间呈上升趋势,其原因是成熟马铃薯在15～35 d经历初休眠期,此时呼吸旺盛,消耗过多营养物质,造成干物质含量急剧下降;贮藏60 d左右呼吸作用减弱,失重率上升速度略有缓和;休眠后期呼吸作用继续加强,营养物质消耗加剧,失重率逐渐升高[26]。上述研究结果与Peng[27]类似。

2.3 UV-C处理对马铃薯贮藏过程中还原糖含量的影响

还原糖含量是衡量马铃薯可否作为加工原料的重要指标,也是影响马铃薯油炸食品颜色的主要因素[28]。UV-C处理对马铃薯贮藏过程中还原糖含量的影响如图2所示。

图2 UV-C处理对马铃薯贮藏过程中还原糖含量的影响Fig.2 Effect of UV-C treatments on reducing sugar content of potato during storage

由图2可知,各组马铃薯的还原糖含量均呈先升后降的趋势,并在45 d达到最大值,且CK组与UV-C处理组的含量差异显著(p<0.05)。相比于初始值,45 d时CK组与一次处理组的还原糖含量分别提高了1.3倍及0.4倍。还原糖含量在0～45 d增加的原因是马铃薯处于休眠阶段,还原糖消耗较少,同时淀粉也不断转化为还原糖,使得还原糖不断积累[29]。贮藏60 d时各组还原糖含量达到最大值,这与王希卓等人[26]的研究一致。贮藏60～105 d(图2b)还原糖在含量下降是因为马铃薯发芽造成呼吸作用加强,还原糖大量消耗。故UV-C处理可抑制还原糖的产生速率,进而保证马铃薯贮藏品质。

2.4 UV-C处理对马铃薯贮藏过程中苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的影响

PAL是酚类物质生物合成途径的关键酶,它与植物抗逆境胁迫和抗病性密切相关。PAL活性越高,植物抗逆境胁迫和抗病性作用越强。UV-C处理对马铃薯贮藏过程中PAL的影响见图3。

图3 UV-C处理对马铃薯贮藏过程中PAL的影响Fig.3 Effect of UV-C treatments on PAL of potato during storage

由图3可知,贮藏0～45 d期间(图3a)，UV-C一次处理组PAL活性逐渐上升,CK组逐渐下降且一次处理组的PAL活性显著高于CK组(p<0.05);贮藏60 d(图3b)时,三组马铃薯的PAL活性均达到最大值,随后不断降低。整个贮藏过程中，二次处理组马铃薯的PAL活性最高,CK组最低。UV-C处理可以诱导马铃薯中PAL的合成[30],因此一次处理组与二次处理组马铃薯中PAL活性较高,这与短波紫外线处理对苹果PAL的影响结果一致[31]。

2.5 UV-C处理对马铃薯贮藏过程中总酚含量的影响

酚类物质为植物次生代谢产物,其含量及生物活性是评价果蔬营养品质的重要指标[32]。不同阶段果蔬的总酚含量变化尽管存在差异,但其变化趋势基本一致,成熟度越低,具有的酚类物质通常越高[33]。UV-C处理对马铃薯贮藏过程中总酚含量的影响见图4。

图4 UV-C处理对马铃薯贮藏过程中总酚含量的影响Fig.4 Effect of UV-C treatments on total phenol content of potato during storage

由图4可知,在贮藏1～45 d期间(图4a),CK组与一次处理组的总酚含量逐渐下降,一次处理组的马铃薯总酚含量大多高于CK组但两组差异不显著(p>0.05)。贮藏60～90 d(图4b),CK组的总酚含量下降,二次处理组的总酚含量相对较高。贮藏60 d时,CK组马铃薯呼吸作用加强,失水率增加使总酚含量较高;一次处理组的马铃薯虽未发芽,但仍有较高的失水率。UV-C二次处理可诱导马铃薯中酚类物质的合成,故总酚含量最高。贮藏后期(75～90 d),一次处理与二次处理的马铃薯总酚含量回升可能是因为UV-C胁迫刺激了马铃薯中次级代谢反应的持续发生,进而促使其在贮藏过程中不断的合成与积累酚类物质[34-36]。多数报道认为总酚含量与PAL活性存在一定相关性,酚类物质是在PAL催化下产生,故90 d后总酚含量下降可能是PAL活性的下降导致[37]。

2.6 UV-C处理对马铃薯贮藏过程中赤霉素(GA3)含量的影响

GA3对于打破马铃薯休眠,促进马铃薯萌发具有重要作用[38]。UV-C处理对马铃薯贮藏过程中GA3含量的影响见表2。马铃薯在休眠期时,GA3含量随贮藏时间的增加而升高,当含量增至一定阈值时会引起马铃薯块茎休眠解除[39],周长艳[40]研究发现4种窖藏条件下马铃薯中的GA3含量先上升后下降。本研究结果表明,CK组与一次处理组的GA3含量呈现先升高后降低的趋势,两组均在45 d达到最大值,分别是贮藏初期的1.95、1.2倍。90 d时,二次处理的马铃薯GA3含量最高(见表2),其原因可能是马铃薯处于休眠期破除阶段,GA3含量接近峰值[40]。

表2 UV-C处理对马铃薯贮藏 过程中GA3含量的影响(μg/g)Table 2 Effect of UV-C treatments on GA3 of potato during storage(μg/g)

2.7 UV-C处理对马铃薯贮藏过程中α-茄碱含量的影响

由表3可知,马铃薯肉质部分α-茄碱与表皮中含量差异较大,薯皮中α-茄碱含量远远高于肉质部分,这与伍慧敏[41]的研究结果一致。贮藏初期,表皮中α-茄碱处于较低水平,含量为14.15 mg/100 g FW,60 d时三组马铃薯表皮的α-茄碱含量迅速增加且均超过规定的安全范围,但三组间差异并不显著(p>0.05);90 d时三组马铃薯已全部发芽,CK组马铃薯表皮中α-茄碱含量最高,分别为一次处理组和二次处理组的1.18倍、1.40倍,但CK组与两种处理组的差异不显著(p>0.05)。可以看出,UV-C处理抑制表皮α-茄碱效果并不理想。马铃薯肉质部分α-茄碱含量随着贮藏时间的延长而增加,但三组马铃薯的肉质部分α-茄碱含量均在规定的安全范围内(≤20 mg/100 gFW)。在贮藏30 d时,CK组α-茄碱显著高于一次处理组和二次处理组(p<0.05);贮藏至90 d,三组马铃薯均已发芽。其中CK组α-茄碱含量最大(1.46 mg/100 g FW),分别为一次处理组和二次处理组的1.39倍、1.52倍(见表3)。

表3 UV-C处理对马铃薯贮藏过程中α-茄碱含量的影响(mg/100 g FW)Table 3 Effect of UV-C treatments on α-solanine of potato during storage(mg/100 g FW)

在整个贮藏期间,CK组马铃薯中α-茄碱的含量大多高于处理组,可见UV-C处理对降低马铃薯中α-茄碱含量具有一定的作用,分析原因为UV-C处理一方面通过抑制发芽减少了α-茄碱的合成,另一方面可能调控α-茄碱的合成与分解,但作用机理尚需进一步研究。

3 结论

采后UV-C照射处理能有效抑制马铃薯发芽,降低发芽率,延长休眠期,且UV-C二次照射处理效果最好,10 ℃贮藏105 d时UV-C一次处理和二次处理的马铃薯发芽率分别为83.66%、68.78%,比CK组分别低11.14%、26.02%。随着贮藏时间的延长,马铃薯失重率、GA3以及α-茄碱含量总体呈上升趋势,还原糖含量及PAL酶活性先升后降,总酚含量逐渐减少,UV-C处理组均可提高马铃薯总酚含量及PAL酶活性,延缓还原糖及α-茄碱含量的升高速度,有效调控GA3的含量并促进总酚的合成,且UV-C二次处理效果最好。UV-C二次处理马铃薯在贮藏90 d时薯皮和肉质部分的α-茄碱含量仅为CK组的71.09%、65.75%。综合来看,UV-C二次照射是抑制马铃薯贮藏中发芽、调控品质的有效处理方式,在马铃薯贮藏中具有潜在的实践应用价值和较好前景。