茶园间作灵芝对土壤细菌多样性和群落结构的影响

李艳春 林忠宁 陆烝 刘明香

摘 要：【目的】探讨茶园间作灵芝对土壤细菌多样性和群落结构的影响，为茶菌间作模式的应用提供科学依据。【方法】应用高通量测序技术分析比较了间作灵芝茶园与单作茶园之间土壤细菌群落变化。【结果】与单作茶园（CK）相比，间作灵芝茶园土壤的有机质、全氮、速效氮和有效磷含量显著提高，速效钾含量和pH显著降低，而全磷和全钾含量变化不显著。间作灵芝茶园处理的土壤细菌群落丰度指数和多样性指数与单作茶园相比无显著性差异。与单作茶园相比，间作灵芝茶园土壤的变形菌门相对丰度显著提高21.18%，而酸杆菌门和芽单胞菌门的相对丰度显著降低15.09%和53.52%，其他细菌门类变化不显著。在属水平上，间作灵芝处理显著提高了土壤有益微生物菌群伯克氏菌属Burkholderia、鞘氨醇单胞菌属Sphingomonas和戴氏菌属Dyella的相对丰度。相关性分析表明，土壤pH、全氮、全磷和速效钾对优势细菌群落的影响较大。【结论】茶园间作灵芝改变了土壤细菌群落结构并提高了土壤中有益微生物菌群的相对丰度，但对土壤细菌群落多样性的影响不明显。

关键词：间作;细菌多样性;细菌群落结构;茶园;高通量测序

中图分类号：S 154文献标识码：A文章编号：1008-0384（2019）06-690-07

Abstract： 【Objective】 Effects of intercropping Ganoderma lucidum among tea bushes on the microbial diversity and community structure in the soil were investigated. 【Method】The microbial communities in the monoculture （CK） and tea bush-G. lucidum intercropping soils were compared using the high-throughput sequencing technology. 【Result】Compared with CK， the intercropping significantly increased the organic matters， total nitrogen， alkali-hydrolyzed nitrogen， and available phosphorus and significantly reduced the available potassium and pH with no significant effect on the total phosphorus and total potassium in the soil. No significant differences were observed on the richness and diversity indices between them. Furthermore， the relative abundance of Proteobacteria in the intercropping soil significantly increased by 21.18% over CK， while that of Acidobacteria declined by 15.09% and that of Gemmatimonadetes by 53.52%， as none found on those of other bacterial phyla. On genus level， the intercropping significantly increased the relative abundance of beneficial microorganisms， such as， Burkholderia， Sphingomonas and Dyella， in the soil. A correlation analysis showed that the pH， total nitrogen， total phosphorus， and available potassium in soil exerted a greater effect on the dominant than the minor bacterial communities. 【Conclusion】 By intercropping G. lucidum among tea bushes， the structure of microbial community in the soil was altered with an increased abundance of beneficial microbial species without significant changes on diversity.

Key words： intercropping; microbial diversity; microbial community structure; tea orchard; high-throughput sequencing

0 引言

【研究意义】茶树是我国重要的特色经济作物。据有关数据统计，2014年我国茶园总面积274.1万 hm2，占全球种茶面积的50%以上;干毛茶总产量达209.2万t，占全球茶叶总产量的41.6%;茶叶出口30.1万t，出口金额达12.7亿美元[1]。我国大部分茶园为山地茶园，在茶叶生产过程中，生产者往往为追求单位面积产量而不断进行茶园清杂，极易造成山地水土流失，破坏山地原有植被和生物多样性，导致茶园生态系统脆弱，病虫害频发等生态问题。另外，由于茶树自身喜酸富铝的生物学特性，茶园土壤正面临着土壤侵蚀、酸化、微生物退化等各种环境问题[2]。随着茶树种植年限的增加，土壤微生物量减少、群落多样性降低、一些对植物生长有益的细菌属急剧减少，而某些病原真菌数量却不断增多，根际土壤环境质量出现整体下降趋势[3-4]。茶园间作作为一项生态栽培措施对丰富茶园生物多样性、改善与优化生态系统具有重要作用。茶园间作食用菌可充分利用茶园内的空间环境和光热水资源，在茶园内进行复合种植的食用菌屬于仿生态野生栽培[5]。土壤微生物作为土壤的重要组成部分，其群落结构多样性及变化在一定程度上反映了土壤的质量和稳定性。探讨茶菌间作对土壤细菌多样性和群落结构的影响，可为茶菌间作模式的应用提供科学依据。【前人研究进展】有研究发现[6]，在幼龄茶园冬季间作大球盖菇能明显提升茶园土壤有机质含量，减缓土壤酸化进程，增加全氮和速效氮含量，减小土壤容重，改善土壤结构。蒋玉兰等研究发现[7]，茶园间作长根菇可明显提高茶叶中茶多糖含量，提高土壤速效氮、磷、钾含量，对土壤有机质和pH影响不明显。杨洪姣等[8]发现茶菌间作时间越长，茶园产量越高，并且能改善茶园土壤环境。此外，有学者研究发现，茶树和食用菌间作模式下，土壤微生物中细菌和放线菌数量的变化均为单作茶园最高，间作两年茶园次之，间作一年的最低[9]。现有的研究大多集中在茶园间作食用菌对土壤理化性质、茶园产量的影响方面，对茶园土壤微生物群落结构和多样性方面的研究相对较少。【本研究切入点】前期研究发现，在成龄茶园间作灵芝，不仅可提高灵芝的品质，同时还可改善土壤肥力，提高茶叶产量与品质，促进茶园增产增收[10]，但间作灵芝对茶园土壤微生态方面的影响还有待进一步分析。【拟解决的关键问题】目前，高通量测序技术具有测序通量高、实验过程简化、速度快、准确率高等特点，比传统的测序技术能更全面反应环境中微生物群落结构[11-12]，已被广泛应用于土壤微生物生态学研究。因此，本研究通过应用Illmina Hiseq高通量测序技术对间作灵芝茶园和单作茶园的土壤微生物群落结构和多样性等方面进行研究，分析比较间作灵芝对茶园土壤细菌群落的影响，以期为茶园间作灵芝模式的应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

试验地位于福建省白水岩茶业有限公司山地茶园（119°4′ E，26°55′ N，海拔982 m）。该地区为亚热带季风气候，年均气温16.8℃，年均降水量 1 842 mm。供试土壤为红壤土。试验开始时耕层土壤基本理化性质为：pH 4.93、有机质含量27.97 g·kg-1、全氮1.13 g·kg-1、碱解氮 132.31 mg·kg-1、有效磷10.17 mg·kg-1、速效钾145.20 mg·kg-1。

1.2 试验设计

于2016年4月5日，设置2个处理：茶园单作（CK）和茶园间作灵芝，分别选取面积不小于50 m2的标准样地各4块。设没有间作灵芝的纯茶园作为对照处理。茶园间作灵芝处理：在茶龄10年的福云6号茶树行间间作灵芝，茶行间距为1.2 m，灵芝品种为赤芝Ganoderma lucidum，编号：韩芝8号;灵芝培养基配方：杂木屑45%，五节芒粉40%，麸皮10%，红糖2%，石膏粉2%，过磷酸钙1%;在茶树的同一侧滴水线内，距离茶树树干25～30 cm开条沟将菌棒埋入土中，每行茶树间种1行灵芝，采用开沟（深20 cm左右、宽20 cm左右）竖栽，菌棒间距5 cm，覆土3～5 cm，按常规灵芝覆土脱袋栽培方法及茶园正常管理方法进行灵芝栽培管理。

1.3 土壤样品采集与分析

于2016年7月8日，按五点采样法采集茶园内间作灵芝行内以及单作茶园中距离茶树树干25～30 cm处的耕层土壤（5～20 cm），去除根系等杂质，过筛后的土壤一部分存于-20℃冰箱于1周内进行土壤细菌多样性分析;一部分经风干后测定土壤理化性质。土壤pH采用电位法（水土比1.0∶2.5）;有机质采用重铬酸钾氧化-外加热法;总氮采用半微量凯氏法、总磷采用Na2CO3熔融法、总钾采用NaOH水解法、速效氮采用碱解扩散法;有效磷采用浸提钼锑抗比色法;速效钾的测定采用火焰光度法[13]。

1.4 土壤DNA提取及高通量测序

称取0.5 g土壤样品，采用CTAB方法提取土壤DNA，采用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度和纯度，将提取的DNA稀释至1 ng·μL-1。以稀释后的DNA为模板，用带Barcode的特异引物515F：5′-GTG CCA GCM GCC GCG GTA A-3′和806R：5′-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3′，对细菌16S V4区进行PCR扩增。PCR采用30 μL反應体系，程序为98℃预变性1 min;30个循环（98℃变性10 s;50℃退火30 s;72℃延伸30 s）;然后72℃延伸5 min（所用仪器为Bio-rad T100梯度PCR仪）。根据PCR产物浓度进行等量混样，充分混匀后使用2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，使用胶回收试剂盒（Qiagen公司）对PCR产物回收。使用TruSeqDNA PCR-Free Sample Preparation Kit （Illumina公司）建库试剂盒进行文库构建，经过Qubit和q-PCR定量检测文库，合格后使用HiSeq2500 PE250进行上机测序（委托北京诺禾致源科技股份有限公司测定）。

1.5 生物信息学分析和数据处理

将测序后的序列截去Barcode和引物序列后使用FLASH（v1.2.7）对每个样品的reads进行拼接，得到原始Tags数据（Raw Tags），经过严格的过滤处理、质量控制和去除嵌合体序列后，得到最终的有效数据（Effective Tags）。利用Uparse软件将全部Effective Tags以97%的一致性进行OTUs（Operational Taxonomic Units）聚类，用Mothur方法与SILVA的SSUrRNA数据库对OTUs代表序列进行物种注释获得分类学信息。

利用Qiime软件（Version 1.7.0）计算物种数（Observed-species）、辛普森多样性指数（Simpson）、香农多样性指数（Shannon）、丰富度指数（Chao1、ACE）以及覆盖率指数（Goods-coverage）。利用R软件（Version 3.4）进行细菌群落间差异分析（主坐标分析和Anosim分析）。采用Excel 2007和MATLAB 7.0软件对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 土壤化学性质

间作灵芝对茶园土壤性质的影响见表1。与茶园单作相比，间作灵芝处理显著增加了土壤有机质（92.27%）、全氮（70.60%）、碱解氮（52.69%）和有效磷（379.68%）含量， 显著降低了速效钾含量（36.65%）和pH（0.67个单位），而对全磷和全钾的影响不显著。

2.2 细菌群落丰度与多样性

高通量测序后共获得476 012条有效序列，茶园单作和间作灵芝处理的平均有效序列分别为59 005和59 998。经过与数据库比对注释后，共获得19 528个OTU（基本分类单元），茶园单作和间作灵芝处理的平均OTU数为2 377和2 505。通过随机抽样方法，以抽到的序列数与它们所代表的OTU数目构建稀释性曲线可直接反映测序数据量的合理性以及间接反映物种的丰富程度，随着序列数的增大，两个处理的细菌稀释曲线均基本趋于平缓（图1），说明测序数据量渐进合理，更多的数据量只会产生少量新的物种（OTUs）。样本文库的覆盖率指数在99.2%以上，说明测序结果能够代表土壤中细菌种群的真实情况（表2）。间作灵芝处理的土壤细菌群落丰度指数（物种数、Chao1、ACE）和多样性指数（Shannon、Simpson）与对照相比无显著性差异，说明间作灵芝并未显著改变细菌群落丰度及多样性。

2.3 细菌群落组成与群落结构

在门水平上，单作和间作灵芝茶园土壤中的优势菌群（相对丰度 > 5%）均为变形菌门Proteobacteria、酸杆菌门Acidobacteria和放线菌门Actinobacteria，其总的相对丰度分别为74.85%和78.95%（图2）。另外，绿弯菌门、拟杆菌门、浮霉菌门、疣微菌门、厚壁菌门、芽单胞菌门、WD272的相对丰度比较低（0.65%～4.74%）。與单作相比，间作灵芝茶园土壤的变形菌门的相对丰度显著提高21.18%（P<0.05），而酸杆菌门和芽单胞菌门的相对丰度显著降低15.09%和53.52%（P< 0.05），其他细菌门类变化不显著。变形菌门由α-变形菌纲、γ-变形菌纲、β-变形菌纲和δ-变形菌纲组成，与单作相比，间作灵芝茶园土壤的β-变形菌纲的相对丰度显著提高121.29%（P<0.05），而α-变形菌纲、γ-变形菌纲和δ-变形菌纲变化不显著（图3）。

单作和间作灵芝茶园处理相对丰度 >0.5%的属分别占总细菌属的22.43%和30.36%（图4）。单作茶园处理的优势属（相对丰度 > 2%）为不动杆菌属Acidibacter、热酸菌属Acidothermus、Candidatus Solibacter;间作灵芝处理的优势属为伯克氏菌属Burkholderia、气单胞菌属Aeromonas、不动杆菌属Acidibacter、Candidatus Solibacter。与单作茶园相比，间作灵芝处理显著增加了伯克氏菌属Burkholderia、根微杆菌属Rhizomicrobium、北里孢菌属Kitasatospora、Chthoniobacter、鞘氨醇单胞菌属Sphingomonas、戴氏菌属Dyella的相对丰度，显著降低了热酸菌属Acidothermus、堆囊菌属Sorangium、柯克斯体属Aquicella的相对丰度。

排序分析（图5）和Anosim分析（P=0.032）表明，单作和间作灵芝处理之间的细菌群落结构差异显著，说明套种灵芝后改变了土壤的细菌群落结构。

2.4 细菌群落结构与土壤理化性质相关性

表3显示，变形菌门与土壤pH值呈显著负相关，与全氮呈显著正相关。酸杆菌门与全氮呈显著负相关，与速效钾呈显著正相关。疣微菌门与全磷呈显著负相关。其他细菌群落与土壤理化性质之间的相关性不显著。

3 讨论与结论

在茶园间作食用菌，从外界投入了大量的栽培料，菌体生长的过程中会形成新的菌丝残体，菌体采收后的菌渣中含有蛋白质、菌体蛋白、氨基酸、酶等各种成分，这些都可能转变成土壤的有机无机肥源。茶园间作大球盖菇明显增加了土壤全氮、速效氮和速效钾的含量[6];茶园间作长根菇也明显提升了速效氮、有效磷、速效钾的含量[7]。与此相似，本研究中间作灵芝处理显著增加了土壤有机质、全氮、速效氮和有效磷含量（表1）。茶树作为叶用植物，对氮素营养的需求高，茶园间作灵芝对土壤养分的增效有利于茶树的生长。此外，茶园间作大球盖菇和长根菇不会降低土壤pH[6-7]，但间作灵芝后会使土壤pH显著下降。灵芝是常见的木腐菌，适宜菌丝生长的环境pH为5.0左右。在灵芝菌丝生长、子实体出芝和出芝后的菌棒腐解过程中，菌棒pH还会进一步降低0.5～0.8个单位。因此，在茶园间作灵芝过程中必须注意土壤pH下降的问题，可以通过补施生石灰和草木灰等来解决该问题。

一些研究者提出富营养和寡营养细菌的概念，并指出β-变形菌纲是富营养细菌，多存在于营养较高的环境中[14-15];而酸杆菌门是寡营养细菌，多存在于营养贫瘠的土壤环境中[16]。本研究发现，与单作茶园相比，间作灵芝处理土壤中的酸杆菌门的相对丰度显著降低，而变形菌门，尤其是β-变形菌纲的相对丰度显著增加（图3），这可能与间作灵芝提高了土壤养分含量相关。据报道，伯克氏菌属、鞘氨醇单胞菌属以及戴氏菌属均是农田土壤中的有益微生物种群，具有促生、拮抗病原菌的作用 [4，17-19]。另外，伯克氏菌是植物根际主要微生物，与植物生长关系密切[20]。本研究发现，间作灵芝后伯克氏菌属成为最优势的细菌属，并且鞘氨醇单胞菌属和戴氏菌属的相对丰度也显著提高。可见，间作灵芝后可有效诱导有益细菌种群在土壤中定殖，改善茶园土壤环境，有利于增强茶树的抗病抗逆能力。

细菌是土壤中多样性最丰富的微生物类群，易受土壤养分、pH 值等外界条件变化的影响。有研究发现，酸杆菌门是嗜酸性细菌，在酸性土壤中生长较好[21]，但本研究发现酸杆菌门与pH之间的相关性不显著，与全氮呈显著负相关。另外，本研究发现，变形菌门与全氮呈显著正相关。其他学者也发现氮肥影响了土壤微生物群落的结构组成，随着氮肥浓度的增加，富养性的分类群落变形菌门丰度增加[22]，与本研究结果一致。可见，间作灵芝处理下氮素养分含量变化对微生物群落结构的影响较大。 与单作相比，茶园间作灵芝可显著增加土壤有机质、全氮、速效氮和有效磷含量。茶园间作灵芝对土壤细菌群落丰度和多样性的影响不明显，但改变了细菌群落结构并促进土壤有益微生物群落生长。因此，茶园间作灵芝有利于改善土壤微生物生态环境。

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（责任编辑：林海清）