新白8号枇杷果肉香气成分及HS-SPME内标浓度分析

张桂彬 安宁 朱立辉 蒋际谋 胡文舜

摘 要：【目的】探究新白8号枇杷香气成分及内标物的最适浓度，以期为白肉枇杷香气成分的研究及内标选择提供依据。【方法】以白肉枇杷新白8号果实为试材，加入4种不同浓度等体积的环己酮溶液（947、94.7、9.47、0.947μg·μL-1）为内标，采用HS-SPME-GC/MS技术，对试材的香气成分进行定性和定量分析。【结果】新白8号枇杷果肉中共检测出10类43种香气成分，以醛类、烷烃、芳香烃、酮类和醇类为主，其中相对含量较高的物质有己醛、（E）-2-己烯醛、正丁基环己烷、2-庚酮、正戊基环己烷、（E）-2-己烯-1-醇，苯乙烯等。4种环己酮浓度的样品分别检测出有效香气化合物为30、39、41和32种，有效峰面积占总峰面积比分别为38.20%、28.49%、42.70%和39.51%;环己酮峰面积比分别为47.38%、58.55%、36.37%和25.86%。加入9.47 μg·μL-1环己酮的样品检测出的香气物质种类最多、有效峰面积比最高、环己酮及各香气成分峰面积占比适宜。【结论】新白8号香气成分丰富多样，9.47 μg·μL-1环己酮为枇杷果实香气成分固相微萃取的适宜内标浓度。

关键词：枇杷;香气;环己酮;内标;固相微萃取;气相色谱-质谱

中图分类号：S 667.3文献标识码：A文章编号：1008-0384（2019）06-660-08

Abstract： 【Objective】 To determine the aromatic composition of loquat fruit and cyclohexanone concentration for the HS-SPME-GC/MS internal standard method. 【Methods】The pulp of Xinbai 8 fruits was added with a cyclohexanone solution in the concentration of 947， 94.7， 9.47， 0.947 μg·μL-1 at a same volume as the internal standard for HS-SPME-GC/MS analysis. 【Results】 The analysis detected 10 classifications of chemicals including aldehydes， alkanes， dutrex， ketones and alcohols. Hexanal， （E）-2-hexenal， n-butyl cyclohexane， 2-heptanone， n-pentyl cyclohexane， （E）-2-hexene-1-alcohol， and styrene were the dominating volatiles among the 43 compounds identified.In the cyclohexanone-added samples， the decreasing concentration produced 31， 40， 42 and 33 aromatic substances with the effective peak area ratios of 38.20%， 28.49%， 42.70% and 39.52%， and the peak area ratios of 38.20%， 58.55%， 36.37% and 25.86%， respectively. A maximum number of aromatics was found in the sample that was added with 9.47 μg·μL-1 cyclohexanone which also had the highest effective peak area ratio and optimum peak area radio. 【Conclusion】The aromatics in the fruits of Xinbai 8 were diverse， and the cyclohexanone concentration at 9.47 μg·μL-1 was the choice internal standard for the analytical.

Key words： loquat; aromatics; cyclohexanone; internal standard; SPME; GC-MS

0 引言

【研究意義】香气是构成和衡量枇杷风味品质的主要因素之一，对消费者购买有着重要影响 [1-2]。白肉枇杷素有鲜食枇杷“无冕之王”美誉，风味浓郁是白肉枇杷的特点之一[3-4]。新白8号作为白肉枇杷优良新品种，于2018年12月通过全国热带作物品种审定（热品审2018007），具有晚熟果大，果肉细腻、化渣、浓甜，投产早且较丰产稳产等优良品质[5]。【前人研究进展】目前，对香气成分的研究常采用顶空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction， HS-SPME）和气质（gas chromatography-mass spectrometry， GC-MS）联用技术，它可以有效地定性和定量鉴别大量物质[6]。色谱分析中常用的定量方法有外标法、内标法和峰面积归一法;内标法由于进样量的变化和色谱条件的微小变化对其定量结果的影响不大而被广泛应用[7]，其关键是选择合适的内标物[8]。现阶段果实香气物质研究报道中，常用的内标物有环己酮（橙、杨梅、草莓、龙眼、梨等）[9-13]、2-辛酮（秋子梨）[14]、 2-辛醇（苹果）[15]等，其中环己酮因化学性质稳定且易挥发而应用较广。【本研究切入点】目前，在枇杷的花[16-17]、果肉[18-19]、果皮[20]等组织的挥发性物质定量上，多采用峰面积归一法;内标法采用极少，可供选择内标物单一，仅见辛醛[21]。关于环己酮的应用未见报道。【拟解决的关键问题】采用HS-SPME-GC/MS联用技术，设置4个不同的内标物（环己酮）浓度，进行新白8号枇杷果肉香气物质定性定量检测和比较分析，以期确定适宜的内标浓度，为枇杷果实香气物质的测定提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验采用白肉枇杷品种新白8号，采自国家果树种质（福州）枇杷圃。6月上旬果实完熟期，从3株树上采取成熟度和大小基本一致的果实，立即拿回试验室随机混合，快速剥离果肉，撕成小块，投入液氮，用锡铂纸包住，置于-80℃超低温冰箱保存待用。

1.2 内标配置

将分析纯级的标准环己酮（质量浓度为 0.947 g·mL-1，中国西亚化工股份有限公司）分别稀释×1倍、×10倍、×100倍、×1 000倍（质量浓度依次为947、94.7、9.47、0.947 μg·μL-1）。

1.3 试验设备

予华DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器;手动固相微萃取（SPME）进样器（美国 Supelco 公司）;50/30 μm DVB/CAR /PDMS 萃取头（美国Supelco公司），使用前充分老化;Agilent 7980 N/5975GC-MS气相色谱质谱联用仪（安捷伦科技有限公司）。

1.4 试验步骤

试验方法根据胡文舜等[22]的方法并进行改进。

样品前处理：果肉用研钵快速研磨成浆，分别称取9.00 g装至有3.00 g NaCl密封顶空瓶中，加入3 mL超纯水和不同浓度的环己酮溶液1 μL，放入转子后旋紧瓶塞，在恒温加热磁力搅拌器（T=37℃，转速=40 r·min-1）中进行平衡15 min。将老化后的萃取头插入样品瓶的顶空位置，保持纤维头距液面约1. 5 cm，调整转速=20 r·min-1，顶空吸附35 min。将萃取垂直插入进样口后推入纤维头，解析5 min。

GC-MS分析：气相色谱条件和质谱条件见蒋际谋等[23]的方法。

1.5 数据分析

将采集到的质谱图通过MAD5975/增强型化学工作站和NIST08标准谱库，根据匹配系数>70，或者匹配系数>40且前三项一致，筛选后，根据其物理化学性质及相关资料核实确定各种化学成分。采用峰面积归一法计算峰面积比;参照吴霏霏等[21]的计算公式计算各成分相对含量f （ng·g-1），并略做改动：

式中：Mi为待测化学成分的峰面积;c为环己酮浓度（μg·μL-1）;V为加入环己酮体积（1μL）;As为环己酮的峰面积;9为果肉质量9 g;1 000为单位转换。采用Origin 9.0软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 新白8号枇杷果实香气成分分析

枇杷果肉挥发性成分SPME-GC /MS扫描总离子流色谱图见图1。经对各个组分数据分析，新白8号枇杷果实中共检测出10类（酯类、醚类、醇类、烷烃、芳香烃、酮类、酸、醛类、酚类及其他），43种香气化合物。其中，×1环己酮下未检测出酚类物质，×100环己酮下检测出最多的香气物质（表1）。其他条件一致情况下，不同的内标浓度下同一物质的相对含量不同，同一内标浓度下的主要香气成分也不同。

2.2 不同内标浓度下的枇杷果实GC/MS色谱图分析

2.2.1 ×1环己酮的色谱图分析 该样品共检测出30种有效香气成分，有效峰面积比为38.20%，环己酮的峰面积比为47.38%。经公式（1）计算，8种相对含量较高化合物分别是正丁基环己烷（19 873.41 ng·g-1）、對二甲苯（17 089.28 ng·g-1）、正戊基环己烷（15 890.51 ng·g-1）、2-庚酮（8 144.71 ng·g-1）、（E）-2-己烯醛（7 896.42 ng·g-1）、己醛（4 908.29 ng·g-1）、苯乙烯（3 442.55 ng·g-1）、乙苯（2 264.31 ng·g-1），为主要香气化合物。2.2.2×10环己酮的色谱图分析 该样品共检出39种有效香气成分，有效峰面积比28.49%，环己酮的峰面积比为58.55%。利用公式（1）计算，8种相对含量较高的化合物依次是（E）-2-己烯醛（1 569.74 ng·g-1）、己醛（1 295.02 ng·g-1）、2-庚酮（503.82 ng·g-1）、正丁基环己烷（278.97 ng·g-1）、正戊基环己烷（207.81 ng·g-1）、对二甲苯（249.82 ng·g-1）、（E）-2-己烯-1-醇（141.39 ng·g-1）、苯乙烯（111.46 ng·g-1），为主要香气成分。2.2.3×100环己酮的色谱图分析 该样品共检测出41种有效香气化合物，其有效峰面积比为42.70%，环己酮的峰面积比为36.37%。由（1）式计算可得，9种相对含量较高的化合物依次是（E）-2-己烯醛（382.22 ng·g-1）、己醛（301.00 ng·g-1）、正丁基环己烷（156.65 ng·g-1）、正戊基环己烷（104.70 ng·g-1）、2-庚酮（65.10 ng·g-1）、（E）-2-己烯-1-醇（34.64 ng·g-1）、苯乙烯（20.67 ng·g-1）、甲酸环己酯（18.76 ng·g-1）、正己醇（17.66 ng·g-1），为主要成分。2.2.4×1 000环己酮的色谱图分析 该样品共检测出32种有效香气物质，其有效峰面积比39.51%，环己酮峰面积比为25.86%。经（1）式计算，7种相对含量较高的香气成分分别是己醛（74.94 ng·g-1）、（E）-2-己烯醛（55.98 ng·g-1）、（E）-2-己烯-1-醇（5.32 ng·g-1）、2，6-二叔丁基对甲酚（2.89 ng·g-1）、正己醇（2.94 ng·g-1）、2-庚酮（1.93 ng·g-1）、（E）-2-己烯酸（1.71 ng·g-1），为主要化合物。2.3 4种内标浓度下新白8号白肉枇杷不同类别香气成分分析

由表1、图2可知，经GC-MS检测，在4种环己酮浓度下，枇杷果肉挥发性化合物主要有10类，峰面积比较高的种类由高到低依次为醛类、烷烃、酮类、芳香烃、醇类化合物，其余种类峰面积比均小于2.5%。其中，环己酮原液为内标时，烷烃类峰面积比最高为41.88%，芳香烃、醛类、酮类和醇类峰面积比分别为27.39%、16.39%、11.55%、0.91%，但未检测出酚类化合物。环己酮10倍液为内标时，醛类物质含量最高，其次依次为酮类、烷烃、芳香烃、醇类，峰面积比分别为57.92%、13.52%、9.59%、7.90%、6.99%。环己酮100倍液为内标时，醛类物质峰面积比最高为56.96%，其次为烷烃、酮类、醇类、芳香烃，其峰面积比依次为21.22%、7.61%、6.04%、4.05%。在环己酮1 000倍液浓度下，醛类峰面积比仍最高为84.26%，但醇类、酮类、烷烃、芳香烃的峰面积比仅6.29%、2.39%、0.99%、0.38%。酯类、酸类、醚类和其他等类别，在不同内标浓度下，其峰面积比差异大。由此可见，其他条件相同情况下，内标浓度不同，主要香气类别的含量也有较明显的差异。3 讨论与结论

3.1 新白8号白肉枇杷果实的主要香气物质

新白8号具有较多优良品质，是有发展前景的晚熟白肉枇杷品种[3]。本研究选用4种浓度环己酮溶液为内标物，对该品种进行果实香气成分的HS-SPME-GC/MS定性和定量分析比较，共鉴定出10类43种香气物质，主要香气类别为酮类（10种）、醇类（8种）和醛类（8种）、烷烃（3种）、芳香烃（3种）;己醛、（E）-2-己烯醛，正丁基环己烷、正戊基环己烷、2-庚酮、（E）-2-己烯-1-醇、苯乙烯等相对含量较高，为新白8号果实的主要香气物质。

在现有的同类研究报道中，吴霏霏[21]采用SPME-GC/MS技术结合内标法进行定量分析，从13种白肉枇杷品种果肉中共鉴定出7类35种香气成分，其中主要类别是烃类（12种）、醇类（11种）、醛类（5种）、醚类（2种），主要香气物质有壬醛、葵醛、2-十六醇、1-二十二醇、alpha-柏木烯、β-紫罗酮等;梁乘榜[24]采用GC/MS法从12种白肉枇杷品种果肉中检测出7类34种香气成分，其果实风味主要来源是醛类和醇类，主要香气物质的是顺-4-环戊烯-1，3-二醇、反式-2-甲基环戊醇、己醛和壬醛等。本试验所测得的香气成分与二者研究共同存在的主要物质有己醛、（E）-2-己烯醛、（E）-2-己烯-1-醇，其他物质有正己醇、甲基庚烯酮、β-紫罗酮、壬醛、葵醛、苯甲醛等，推测这些化合物为白肉枇杷的共同香气物质;而正丁基环己烷、正戊基环己烷、2-庚酮、苯乙烯是以上研究所没有的，推测为新白8号果肉的独特香气物质。本研究测得新白8号枇杷果实香气成分丰富多样，这也证实了环己酮可以作为枇杷果实香气成分测定的内标物。

3.2 枇杷果实香气成分GC/MS检测的适宜内标浓度

相同条件下，适宜的内标物及其浓度能检测出较多的香气成分，且各成分峰面积占比合理。本研究在947 μg·μL-1环己酮为内标的样品中检测出的香气成分种类和类别最少;94.7 μg·μL-1环己酮中有效峰面积比最小且环己酮峰面积比过高;0.947 μg·μL-1环己酮中醛类峰面积比过高。但在9.47 μg·μL-1环己酮为内标时，检测出的香气成分种类最多（42种）、有效峰面积比最高（42.70%）、环己酮峰面积占比（36.37%）适宜。表明在4种环己酮浓度中，9.47 μg·μL-1为枇杷果实香气成分固相微萃取的内标物最佳浓度。

吴霏霏[21]以0.082 1 g·L-1辛醛为内标，在白肉枇杷品种‘槐焚’果肉中测得己醛峰面积比为24.35%;‘山东鸡蛋白’果肉中主要香气类别的峰面积比由高到低依次为醛类56.71%、醇类27.28%、烃类8.85%、醚类6.26%。本试验在9.47 μg·μL-1环己酮下，测得己醛峰面积比为24.36%;醛类、烷烃、酮类、醇类、芳香烃的峰面积比分别为56.96%、21.21%、7.61%、6.04%、4.05%。这与吴霏霏的试验结果基本相符，表明在9.47 μg·μL-1环己酮下检测出的香气物质峰面积比适宜。由此可见，9.47 μg·μL-1为枇杷果实香气成分固相微萃取的内标物（环己酮溶液）的适宜浓度，有利于枇杷果实香气物质的HS-SPME-GC/MS检测与分析。

参考文献：

[1]OLUWAFEMI J，CALEB O A，FAWOLE R R，et al.Impact of preharvest and postharvest factors on changes in volatile compounds of pomegranate fruit and minimally processed arils-Review[J].Scientia Horticulturae，2015， 188.[2]

陈薇薇，孙海艳，蒋赟等.枇杷香气成分固相微萃取条件的正交试验优化[J].食品科学，2015，36（24）：35-39.

CHEN W W，SUN H Y，JIANG Y，et al.Orthogonal Array Optimization of Solid Phase Micro-Extraction Conditions for Loquat Aroma Compounds[J].Food Science，2015，36（24）：35-39.（in Chinese）[3]

清揚.又白，又大，又早——福建省农科院培育出系列特早熟枇杷新品种[J].果农之友，2018（5）：46-47.

QING Y.White， large and early-A series of new varieties of loquat developed by Fujian Academy of Agricultural Sciences[J].Fruit Growers' Friend，2018（5）：46-47.（in Chinese）[4]

谢丽雪，许家辉，张立杰，等. 24份白肉枇杷种质资源的ISSR分析[J].福建农业学报， 2012，27（3）：261-266.

XIE L X，XU J H，ZHANG L J，et al.Genetic Relationship Analysis of 24 White-fleshed Loquat （Eriobotrya japonica）Germplasms by ISSR[J].Fujian Journal of Agricultural Sciences，2012， 27 （3）：261-266.（in Chinese）[5]

郑少泉，蒋际谋，许家辉，等.优质大果晚熟白肉枇杷新品系——新白1号、新白3号、新白8号 [J].福建农业学报，2006，21（1）：48-50.

ZHENG S Q，JIANG J M，XU J H，et al.New white flesh loquat strains Xinbai 1，Xinbai 3 and Xinbai 8 with large-type，high-quality and late-ripening traits[J].Fujian Journal of Agricultural Sciences， 2006，21（1）：48-50.（in Chinese）[6]

李俊星，钟玉娟，罗剑宁，等.基于顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱技术分析香芋南瓜叶片的香气物质成分及特征[J].浙江大学学报（农业与生命科学版），2019，45（2）：1-5.

LI J X，ZHONG Y J，LUO J N，et al.Detection of volatile flavor compounds in leaf of Xiangyu pumpkin using headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry[J]. Journal of Zhejiang University （Agriculture & Life Sciences），2019，45（2）：1-5.（in Chinese）[7]

李健隽.面积归一化法分析混合气体中各组分含量[J].计量与测试技术，2012，39（4）：86，88.

LI J J.Analysis the Content of Each Component in Mixed Gas with Area Normalization Method[J].Metrology and Measurement Technique，2012，39（4）：86，88.（in Chinese）[8]

李好枝. 体内药物分析[M]. 北京：中国医药科技出版社，2011：212-214.

LI H Z.Biopharmaceutical Analysis[M].Beijing：China Medical Science Press，2011：212-214.（in Chinese）

[9]张沛宇，刘珞忆，陈婷婷，等.‘奥林达’夏橙主要香气成分在贮藏保鲜过程中的变化[J].果树学报，2018，35（7）：859-869.

ZHANG P Y，LIU L Y，CHEN T T，et al.The variations in major aroma compounds in ‘Olinda'Valencia orange（Citrus sinensis）during storage[J].Journal of Fruit Science，2018，35（7）：859-869.（in Chinese）[10]

吴文艳，陈健乐，陈荣荣，等.HS-SPME-GC/MS结合PCA分析不同成熟度东魁杨梅香气组分差异[J].中国食品学报，2017，17（12）：236-242.

WU W Y，CHEN J L，CHEN R R，et al.Volatiles of Chinese Bayberry during Different Using HS-SPME-GC/MS Combined with PCA[J].Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology，2017，17（12）：236-242.（in Chinese）[11]

王玲，尹克林.‘达赛莱克特’草莓果实发育成熟过程中香气物质的变化及其特征成分的确定[J].果树学报，2018，35（4）：433-441.

WANG L，YIN K L.Changes in aroma of 'Darselect'strawberry during development and characterization of the key aroma components[J].Journal of Fruit Science，2018，35（4）：433-441.（in Chinese）[12]

张义，高蓓，徐玉娟，等.顶空固相微萃取-气质联用方法分析龙眼中的挥发性化合物[J].食品科学，2010，31（16）：156-160.

ZHANG Y，GAO B，XU Y J，et al.Determination of Volatile Compounds in ‘Chuliang’ Longan Using Headspace Solid-phase Microextraction and GC-MS[J].Food Science，2010，31（16）：156-160.（in Chinese）[13]

涂俊凡，秦仲麒，李先明，等.砂梨和庫尔勒香梨果实香气物质的GC-MS分析[J].湖北农业科学，2011，50（15）：3186-3190.

TU J F，QIN Z Q，LI X M，et al.Analysis of Fruit Aromatic Components of Pyrus pyrifolia Nakai and P.sinkiangensis yü by GC-MS[J].Hubei Agricultural Sciences，2011，50（15）：3186-3190.（in Chinese）[14]

乌云塔娜，蒋贺喜格，康秀.中国秋子梨品种果实香气成分比较分析[J].中国南方果树，2015，44（3）：103-107.

WU Y T N，JING H X G，KANG X.Comparative analysis of aroma components in Pyrus ussuriensis fruit[J].South China Fruits，2015，44（3）：103-107.（in Chinese）[15]

慈志娟，田利光，张序，等.脱毒‘烟富3号’与未脱毒‘烟富3号’苹果香气成分差异分析[J].中国果树，2019（2）：50-52.

CI Z J，TIAN L G，ZHANG X，et al.Analysis on the difference of aroma components between virus-free Yanfu 3 and non-detoxified Yanfu 3 apple[J].China Fruits，2019（2）;50-52.（in Chinese）[16]

丰珂珏，刘琼琼，杨晓萍.枇杷花袋泡茶香气特征及挥发性成分分析[J].湖北农业科学，2014，53（15）：3582-3587.

FENG K Y，LIU Q Q，YANG X P.Analyzing Aroma Characteristics and Volatile Components of Loquat Flower Tea-bag[J].Hubei Agricultural Sciences，2014，53（15）：3582-3587.（in Chinese）[17]

芦艳，鲁周民，樊美丽，等.枇杷花开放过程挥发性物质变化研究[J].园艺学报，2013，40 （11）：2245-2254.

LU Y，LU Z M，FAN M F，et al.Changes of Volatile Components During Different Stages of Loquat Flowers[J].Acta Horticulturae Sinica，2013，40 （11）：2245-2254.（in Chinese）[18]

袁婷，陈薇薇，孙海艳，等.不同果肉类型枇杷果肉挥发性成分分析[J].食品科学，2018，39（24）：209-217.

YUAN T，CHEN W W，SUN H Y，et al. Analysis of the Volatile Components in Loquats with Different Flesh Colors[J].Food Science，2018，39（24）：209-217.（in Chinese）[19]

BESADA C，SALVADOR A， SDIRI S，et al.A combination of physio logical and chemometrics analyses reveals the main associations between quality and ripening traits and volatiles in two loquat cultivars[J].Metabolomics，2013，9（2）.324-336.[20]

張巧，顾欣哲，吴永进，等.枇杷果皮热风干燥前后功能性成分含量变化与挥发性成分分析[J].食品科学，2016，37（16）：117-122.

ZHANG Q，GU X Z，WU Y J，et al.Analysis of Functional Components and Volatile Components from Loquat Peel Before and After Hot-Air Drying[J].Food Science，2016，37（16）：117-122.（in Chinese）[21]

吴霏霏.枇杷果实香气检测及AAT1基因克隆表达与酶活性分析研究[D].扬州： 扬州大学，2015.

WU F F.Aroma analysis and AAT1 gene cloning and expression and enzyme activity detection of loquat  fruit[D].Yangzhou：Yangzhou University，2015.（in Chinese）[22]

胡文舜，蒋际谋，黄爱萍，等.‘晚香’龙眼果实香气成分的3种萃取头GC-MS效果分析[J].福建农业学报，2015，30（12）：1149-1154.

HU W S，JIANG J M，HUANG A P，et al.GC-MS Analysis on Aromatics of Wanxiang Longans Using Different Extraction Fibers[J].Fujian Journal of Agricultural Sciences，2015，30（12）：1149-1154.（in Chinese）[23]

蒋际谋，胡文舜，许奇志，等.枇杷品种香甜和解放钟及两者杂交子代优系果实香气成分分析[J].植物遗传资源学报，2014，15（4）：894-900.

JIANG J M， HU W S， XU Q Z，et al.Volatiles in Fruits of Two Loquat Cultivars Xiangtian，Jiefang zhong and Their Two Offspring Selections[J].Journal of Plant Genetic Resources，2014，15（4）：894-900.（in Chinese）[24]

梁乘榜.枇杷果实品质分析及CCD1基因克隆与表达研究[D].扬州：扬州大学，2013.

LIANG C B.Quality analysis and CCD1 gene cloning and expression of loquat （Eriobotrya japonica） fruit[D].Yangzhou：Yangzhou University，2013.（in Chinese）

（责任编辑：黄爱萍）