八仙花NRAT1基因的克隆及表达分析

李志奇 陈海霞

摘 要：【目的】铝胁迫是酸性土壤中限制植物生长的重要元素，八仙花是一种富集铝的园林观赏植物;本研究对八仙花NRAT1基因进行生物信息学分析及表达分析，以期揭示NRAT1基因在耐铝生理中的作用。【方法】以八仙花品种Hydrangea macrophyllacv laybla为材料，提取RNA进行RT-PCR，检测实时表达情况，克隆NRAT1基因全长并进行生物信息学分析。【结果】试验克隆得到了巨噬基因家族的NRAT1基因全长，该基因有1个1 881 bp的开放阅读框，编码548个氨基酸。多重序列分析表明其具有相当高的保守性，该蛋白有12个跨膜结构，预测位于质膜或液泡膜上，预测结果显示该蛋白是一个疏水性蛋白，试验还分析得到了蛋白质的二、三级结构。 RT-PCR试验表明，NRAT1基因在八仙花的根、茎、叶中均有表达，3个组织中NRAT1基因随着处理时间的增加表达量先升后降，在处理2 h表达量达到顶峰，之后维持低水平表达，在12 h之后基因表达被抑制，在根中的平均表达量最高且表达量变化幅度最大。【结论】NRAT1基因在八仙花感受铝胁迫时，表达量立即上调，NRAT1基因参与了八仙花铝离子的吸收和转运，在八仙花铝富集作用中扮演了重要角色。

关键词：八仙花;NRAT1基因;铝胁迫;表达分析

中图分类号：S 682.3文献标识码：A文章编号：1008-0384（2019）06-646-06

Abstract： 【Objective】Bioinformatics and expression of NRAT1 gene of the ornamental Hydrangea macrophylla plants that tend to accumulate aluminum （Al）， a growth-limiting heavy metal in acidic soil， were studied to understand the physiology of the plant on Al-tolerance.【Method】The RNA of H. medalensis cv. Laybla was extracted for RT-PCR to detect the real-time expression and cloned for bioinformatic analysis to determine the molecular structure of NRAT1. 【Result】 The cloned macrophage gene obtained in the lab revealed that the gene had a 1 881 bp open reading frame and encoded 548 amino acids. A multiple sequence analysis showed it to be highly conservative with 12 transmembrane structures located on the plasma or vacuole membrane. The secondary and tertiary structures of the hydrophobic protein were obtained. RT-PCR indicated that NRAT1 was expressed in the roots， stems and leaves of H. macrophylla， and the expressions increased initially to peak in 2h followed by a decline with time to a levered low level. After 12h under Al-stress， the expression was completely inhibited. Among the three issues， the roots had the highest expression and were affected the most by the stress. 【Conclusion】 The NRAT1 gene expression was up-regulated in Hydrangea macrophylla immediately upon the exposure to Al. The gene was positively confirmed to participate in the absorption and transport of Al ions playing an important role in the heavy metal accumulation in the plants.

Key words： Hydrangea macrophylla; NRAT1 gene; Aluminum stress; expression analysis

0 引言

【研究意义】铝是地壳中分布最广、含量最多的金属元素，在酸性土壤中铝胁迫是限制植物生长及作物产量的一个重要因子。我国酸性土壤约占国土总面积的21%[1]。针对酸性土壤中的铝胁迫问题，过去多采用石灰对表层土壤进行改良，但用量大，且要长期使用，费用高，容易导致土壤板结[2]。现代社会发展迅速，随着酸性气体排放的增加，酸雨越来越多，酸性土壤的面积也在逐渐扩大，因此对植物耐铝机制的研究已经广泛开展，对已知的耐铝植物进行开发，显得尤为重要。

【前人研究进展】八仙花Hydrangea macrophylla又名绣球，是虎耳草科八仙花属的落叶灌木，花序大且密集，花色丰富，主要分布于中国、日本，近年来在欧洲也常用做庭院植物，常用于鲜切花、園林绿化，是一种重要的观赏植物。同时八仙花是一种富集铝的植物，几个月内叶片中的铝积累量可达5 mg·g-1[3，14-15]，具有非常重要的科研价值。NRAT1基因属于NRAMP基因家族，在铝胁迫下该基因在八仙花的根和叶中均有上调表达[4]。

【本研究切入点】 基于目前对八仙花抗铝的生命活动及转运机制研究尚不成熟，抗性基因在植物抗逆活动中发挥着重要作用，本研究从NRAT1基因的表达分析及生物信息学分析出发，解析其在调控抗铝活动中的功能。【拟解决的关键问题】为研究八仙花与抗铝生命活动密切相关的NRAT1基因，本试验以耐铝品种八仙花Hydrangea macrophyllacv laybla为材料，采用不同浓度的铝处理，并提取RNA进行实时荧光定量PCR，解析铝胁迫下八仙花NRAT1基因在吸收、转运和贮存铝离子过程中的作用，阐明NRAT1基因的时空特异性表达与八仙花耐铝的关系，以期为园林植物和农作物耐铝遗传改良提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以取自湖南农业大学花卉基地温室苗圃的八仙花品种 Hydrangea macrophylla cv laybla为材料，在晴朗天气的上午剪取当年生的绿色枝条，在温度为18℃，空气湿度为60%的条件下以蛭石为基质扦插培养。

1.2 提取RNA和cDNA第一链的合成

用50 mol·L-1的氯化铝溶液处理扦插小苗，在不同的时间点（0、2、4、8、12、24 h）取八仙花的根、茎、叶。液氮研磨，采用植物总RNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司）提取总RNA，采用微量分光光度计检测各部位、各时间的RNA浓度和质量，置于-80℃冰箱保存。将RNA通过逆转录HiFiScript cDNA 第一链合成试剂盒（购于CWBIO康为世纪生物科技有限公司）获得cDNA第一链，置于-20℃冰箱备用。

1.3 NRAT1基因的克隆

参考八仙花NRAT1基因的cDNA序列，综合NCBI网站的数据库，设计特异性引物，以cDNA第一链为模板，在BIO-RAD PCR仪中进行扩增，在PCR仪上进行如下反应：94℃，1 min→98℃，10 s;65℃，15 s;72℃，2 min;30个循环→72℃，10 min，将扩增后的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后将PCR产物切胶回收，连接到载体中，转化大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性克隆，送交公司测序。

1.4 生物信息学分析

从NCBI GenBank数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）中下载NRAT1基因相对应的其他物种的同源序列;利用ProtParam分析核酸及氨基酸序列的组成成分及理化性质;利用TMHMM 2.0、Tmpred、ProtScale、SignalP 4.1 和WoLF PSORT分析蛋白跨膜结构域、亲水性/疏水性;利用SOPMA分析蛋白质的二级结构;蛋白磷酸化位点分析采用KinasePhos。利用SWISS-MODEL分析蛋白质的三级结构。

1.5 实时荧光定量PCR分析

从-80℃冰箱中取出0、2、4、8、12、24 h的根、茎、叶的RNA，使用primer premier 5设计引物QPCR-F、QPCR-R（表1）按照TransStart Tip Green qPCR SuperMix试剂盒（购于全式金生物技术有限公司）的说明书，交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，以18S RNA为内参基因，用RT-PCR仪（BIO-RAD CFX ConnectTM Optics Module）进行实时荧光定量PCR，得到的数据采用GraphPad Prism 7软件分析。

2 结果与分析

2.1 八仙花RNA的提取

通過微量分光光度计检测RNA的纯度和浓度，测定结果显示在260～280 nm波长时，OD值介于1.8～2.0，经1.5%琼脂糖凝胶电泳，得到图1，条带清晰，无拖尾等不良现象。说明提取的RNA完整度良好，可以进行下一步试验。

2.2 NRAT1 cDNA全长序列的克隆和分析

采用在线软件ProParam分析得到NRAT1基因编码的蛋白质的理化性质，结果表明，本研究NRAT1基因的开放阅读框长为1 881 bp，编码548个氨基酸，编码蛋白的化学方程式为C2769H4379N689O743S20，分子量为59 851.60 Da;理论等电点为7.13，为碱性氨基酸;分析该基因编码的氨基酸组成，Leu、Ile、Ala、Gly、Val、Ser含量较多，不含Pyl和Sec;负电荷残基（Asp+Glu）有39个，正电荷残基（Arg + Lys）有39个;不稳定指数为33.84，表明该蛋白为稳定性蛋白;脂肪系数为124.22，亲水性平均值（GRAVY）为0.575。

2.3 NRAT1的同源性比较

通过NCBI Blast程序对蛋白序列进行同源性比对，结果表明八仙花NRAT1氨基酸序列与栓皮栎（Quercus suber XP_023908030.1）的同源性最高，达84%，与芝麻（Sesamum indicum XP_011102329.1）和苹果（Malus domestica XP_008361001.1）的同源性为83%，与猕猴桃（Actinidia chinensis PSS31888.1）的同源性为82%，与向日葵（Helianthus annuus XP_022038566.1）的同源性为80%，与甜樱桃（Prunus avium XP_021806639.1）和月季（Rosa chinensis XP_024166371.1）的同源性为79%，与玉米（Zea mays XP_008670085.1）的同源性为74%，与小米（Setaria italica XP_004959136.1）的同源性为73%，与高粱（Sorghum bicolor XP_002459640.1）的同源性为69%，与粳稻（Oryza sativa XP_015647626.1） 的同源性为55%。对上述NRAT1氨基酸序列进行多重序列比对，结果表明，不同植物NRAT1的结构是高度保守的。

2.4 NRAT1蛋白功能预测分析

利用TMpred和TMHMM Server v.2.0在线软件预测NRAT1氨基酸序列的跨膜结构域，结果（图2）表明，该基因编码的蛋白含有12个跨膜结构域，由19或22个疏水氨基酸残基组成，分别位于48～67位氨基酸、87～109位氨基酸、130～152位氨基酸、156～178位氨基酸、187～209位氨基酸、229～251位氨基酸、272～294位氨基酸、332～354位氨基酸、374～396位氨基酸、400～422位氨基酸、435～457位氨基酸和472～494位氨基酸。通过在线软件WoLF PSORT对NRAMP1进行预测，结果表明，该蛋白主要定位在质膜和液泡。

通过在线软件KinasePhos分析磷酸化位点，发现八仙花NRAT1编码蛋白磷酸化位点共有5个，丝氨酸位点数目有2个，分别位于第305和332位氨基酸处;酪氨酸有3个磷酸化位点，分别位于第34、55和208位氨基酸处。

利用ProtScale在线工具对NRAT1氨基酸序列的亲水性和疏水性进行预测，结果（图3）表明，NRAT1蛋白氨基酸残基中以缬氨酸V193疏水性最强 （3.678），以天冬氨酸D41亲水性最强 （-3.211），存在明显的疏水区域，故NRAT1蛋白疏水性较强，为疏水性蛋白。

利用SOPMA预测方法对NRAT1编码的蛋白质进行二级结构预测，结果（图4）表明，其二级结构中ɑ螺旋（Alpha helix）、无规则卷曲（Random coil）、延伸链结构（Extened strand）以及β转角（Beta turn）分别占51.82%、31.93%、13.50%和2.74%，说明蛋白质二级结构的主要类型是ɑ螺旋和无规则卷曲，其次是延伸链，β转角结构所占比例最小。

通过Swiss-Model数据库采用同源建模的方法预测NRAMP蛋白的三级结构，得到图5，可以看出三级结构主要由ɑ螺旋、无规则卷曲、延伸链以及β转角等二级结构元件组成，其空间结构高度相似，具有高度保守的结构特征，但在拓扑结构存在差异，表明NRAT1蛋白在不同植物中可能具有自己独特的功能。

2.5 NRAT1基因的表达特性分析

以铝处理后不同时间、不同部位的八仙花RNA为材料，以18S RNA为内参基因，用实时荧光定量PCR的办法检测NRAT1基因在八仙花的根、茎、叶中的转录水平（图6）。荧光定量PCR试验结果显示，NRAT1基因的扩增曲线趋势正常、基线平整、熔解曲线峰值单一，引物特异性较好，未产生非特异性扩增。在没有铝胁迫的对照组中，NRAT1基因在八仙花的根、茎、叶中均有表达，其中茎>叶>根。NRAT1基因随着处理时间的增加表达量呈现先升后降的趋势，在铝胁迫2 h后，各部位的表达量均达到最大值，随后逐渐降低，在12 h之后其表达水平比对照组更低。NRAT1基因在不同组织中的表达也有较大差异，总平均表达量根>叶>茎。

3 讨论与结论

天然抗性相关巨噬细胞蛋白（NRAMP）家族基因最早是在动物组织中被克隆，现在在植物、微生物中均有发现[5，14]，其作用是在铝离子进入细胞后，将铝离子转运、储存在植物的液泡中或其他亚细胞隔室内，进而降低因高浓度的金属离子对细胞壁产生的毒害作用，在金属离子的转运调控和维持金属离子平衡中发挥重要作用。Xia等[6，12-13，20]在水稻中发现一个铝抗性相关的 NRAMP 家族基因NRAT1，敲除NRAT1基因會减弱水稻铝离子的吸收，增加铝离子与细胞壁的结合进而增加水稻的铝敏感性。预测其是位于根尖细胞的质膜上的铝离子转运蛋白。

本研究结果表明，NRAT1基因翻译的蛋白质具有相当的稳定性，而且有多达12个的跨膜结构域，预测其位置是位于八仙花细胞膜或液泡膜上，杨猛等[7]在对水稻中的OsNRAMP5基因研究预测也是位于液泡膜上，OsNRAMP5基因在水稻中广泛分布且参与了Mn离子的转运，对该基因进行基因沉默后，水稻长势严重受阻。尹华等[8]及肖海华等[9]在衣藻和山荆子中的研究表明NRAMP1基因参与了金属离子转运，并且结果得出该基因具有高度保守性，本试验的同源性分析叶表明各物种之间的NRAT1基因具有相当高的同源性，因此预测NRAT1基因是一个高度保守的基因。

本研究中八仙花NRAT1基因在植物的根、茎、叶中均有表达，其中根部表达量最多且变化幅度最大，与茎和叶相比有显著性差异，由此推断八仙花可能是从根部感受铝胁迫，根部铝胁迫最为严重，因此产生应激反应之后，NRAT1基因在根中表达较多，焦芳婵等[10]对烟草中NtNramp1-1基因的研究表明，与拟南芥[14，17]、棉花[19]、大豆[21]等克隆的 Nramp-1 基因具有较高的序列相似性，同时在根中NtNramp1-1基因有高水平的表达。刘晓敏等[11，18]在蒲公英中TaNRAMP基因的研究得出TaNRAMP基因参与了Cd离子的转运，其表达量在2 h时表达量达到峰值，随后迅速降低，维持低水平的表达，本试验中八仙花应激机制反应迅速，表达量在2 h的时候达到最大值，在铝处理12 h之后，NRAT1基因表达受到抑制，表达量相较蒸馏水处理的对照组更少，推测长时间的铝毒害会破坏八仙花的生理结构，阻碍NRAT1基因的正常表达。

八仙花在感受铝胁迫时，会采用许多内部或外部的反应机制应激，从而产生一系列的生理活动， NRAT1基因在八仙花感受铝胁迫时，表达量立即上调，参与铝离子的消化、转运等生理活动，本研究阐明在八仙花富集铝中NRAT1基因的作用，以期为园林植物抗铝性的遗传改良提供重要的理论基础，为铝污染的土壤改善绿化提供技术支持。

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（責任编辑：林海清）