熊果酸对胶原诱导性关节炎大鼠关节炎症相关因子mRNA表达的影响

鲜瑶瑶 周俭 曾光 王莘智 刘沙 徐豫湘

〔摘要〕 目的 研究熊果酸（ursolic acid，UA）对胶原诱导性关节炎（collageninduced arthritis， CIA）大鼠关节X线及关节炎症相关因子mRNA表达的影响。方法 SD大鼠采取皮下注射牛Ⅱ型胶原加弗氏不完全佐剂法建立CIA模型，取造模成功后大鼠随机分为CIA模型组、UA低剂量组、UA高剂量组、甲氨喋呤（methotrexate， MTX）组、UA+MTX组并予以对应干预。另取6只正常大鼠为对照的空白组。初次免疫30 d断颈处死大鼠，关节行X线摄片，再取下大鼠炎症关节组织匀浆，提取RNA，荧光定量PCR法检测IL-17A、IL-10、IL-6、TNF-α、IL-1β、TGF-β的mRNA表达。结果 与CIA模型组相比，UA高剂量组、MTX组、UA+MTX组X线评分减低（P<0.05或P<0.01）;各治疗组IL-17A、IL-6、TNF-α、IL-1β的mRNA表达降低（P<0.01或P<0.05）;各治疗组IL-10、TGF-β因子的mRNA表达增高（P<0.01或P<0.05）。结论 UA可明显缓解CIA大鼠关节炎症，改善关节X线评分，其机制可能与调节炎症因子的产生，维持组织促炎因子与抑炎因子的平衡有关。

〔关键词〕 熊果酸;类风湿关节炎;胶原诱导性关节炎;X线评分;炎症因子

〔中图分类号〕R285.5;R593.22        〔文献标志码〕A       〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.06.003

〔Abstract〕 Objective To investigate the effects of ursolic acid （UA） on the articular X-ray and mRNA expressions of joint inflammation-related factors in collagen-induced arthritis （CIA） rats. Methods SD rats were given subcutaneous injection of bovine type II collagen plus Freund's incomplete adjuvant for modeling. After successful modeling， the rats were randomly divided into a CIA model group， a UA low-dose group， a UA high-dose group， a methotrexate （MTX） group and a UA + MTX group and they were given corresponding intervention. Another 6 normal rats were selected as the control group. Rats were sacrificed by neck breaking after 30 d of primary immunization， and the joints were taken X-ray. The tissue homogenate of rat's inflammatory joint was removed and RNA was extracted. The expressions of IL-17A， IL-10， IL-6， TNF-α， IL-1β， TGF-β and mRNA were detected by fluorescence quantitative PCR. Results Compared with the CIA model group， the X-ray scores of the UA high-dose group， the MTX group， and the UA + MTX group were decreased （P<0.05 or P<0.01）; the mRNA expressions of IL-17A， IL-6， TNF-α and IL-1β in each treatment group were decreased （P<0.01 or P<0.05）; the mRNA expressions of IL-10 and TGF-β in each treatment group were increased （P<0.01 or P<0.05）. Conclusion UA can significantly alleviate joint inflammation in CIA rats and improve the articular X-ray score. The mechanism may be related to regulating the production of inflammatory factors and maintaining the balance between tissue pro-inflammatory factors and anti-inflammatory factors.

〔Keywords〕 ursolic acid; rheumatoid arthritis; collagen-induced arthritis; X-ray score; inflammatory factor

類风湿关节炎（rheumatoid arthritis， RA）是一种以侵蚀性关节炎为主要临床特征的慢性自身免疫性疾病，其基本病理改变为滑膜炎、血管翳形成，可侵犯关节软骨、软骨下骨、韧带和肌腱等，造成关节软骨、骨和关节囊破坏。随着病程的进展，RA患者残疾和功能受限发生率升高[1]，及早发现并进行干预治疗，延缓患者病情进展以及减轻患者痛苦，具有重要意义。RA的西医发病机制尚不明确，目前多采用非甾体类抗炎药（nonsteroidal antiinflammatory drugs， NSAIDs）联合改善病情的抗风湿药物（disease modifying anti-rheumatic drugs， DMARDs）治疗，长期使用不良反应较多。从传统中药中寻找和开发高效、低毒的抗风湿新药是临床的迫切需求。

熊果酸（ursolic acid，UA）又名乌苏酸、乌索酸，主要存在女贞子、山楂、陆英、夏枯草、车前草、白花蛇舌草、连翘、苦丁茶、甘草、连翘等药用植物中，在夹竹桃、连翘叶、枇杷叶和白花蛇舌草中UA的含量最高[2]。研究表明UA具有广泛而温和的抗炎[3]、抗病毒、抗变态反应、保护胃黏膜和免疫调节等药理作用[4-5]，UA也显示出抗抑郁、心脏保护、肾保护、神经保护、胃肠保护、平喘、抗激素、抗关节炎和抗诱变作用[3]。RA是一种慢性炎症性自身免疫性疾病，胶原诱导性关节炎（collageninduced arthritis， CIA）是最经典应用最广泛的RA模型复制方法[6]，本实验通过大鼠CIA模型来研究UA对关节炎影响，现具体报道如下。

1 材料与方法

1.1  材料

1.1.1  动物  SPF级健康SD大鼠，8周龄，雌性，体质量（120±10）g，购于斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SYXK（湘）2018-0005，实验动物质量合格证号：11400700151972;饲养处及实验基地：湖南中医药大学实验动物中心SPF级实验室，正常饲养一周后实验。

1.1.2  试剂  牛Ⅱ型胶原（美国Chondrex，货号：20021）;弗氏不完全佐剂（Sigma，批号：BJ-012-0392）;熊果酸标准品（质量分数98%），Delta标准品公司提供，货号：110742，采用二甲基亚砜（DMSO，阿拉丁，货号：D103283）溶解;甲氨喋呤（methotrexate， MTX）注射液（规格：5 mg/支，山西普德药业有限公司，批号02180101）;RNA提取液trizol（Invitrogen，货号：15596018）。引物：生工生物工程（上海）股份有限公司。PCR Mix试剂盒（立陶宛Fermentas）。

1.1.3  仪器  MF-150G型Digital Diagnose X线片摄片机（美国BENNETT公司）;7500PCR仪（美国ABI）;T10 basic匀浆机（德国IKA）。

1.2  方法

1.2.1  造模与评估  取70只雌性SD大鼠，随机取6只作为正常对照组（空白组），其余大鼠均复制CIA模型[7]，将溶于醋酸的牛Ⅱ型胶原（浓度为2 mg/mL）与弗氏不完全佐剂（IFA）等体积混合，充分乳化，制成Ⅱ型胶原乳剂（1 mg/mL）。在无菌条件下，于大鼠尾根部皮下注射（0.2 mL/只）配制好的Ⅱ型胶原乳剂，初次免疫当天作为0 d，第7天按上述方法、相同剂量（0.2 mL/只）加强1次。空白组注射等体积的生理盐水。用关节炎指数作为判断模型是否成功的标准。肢体关节肿胀按0-Ⅳ级评分：0，无红肿;Ⅰ，趾关节稍肿;Ⅱ，趾关节及足趾关节肿胀;Ⅲ，踝关节以下足爪肿胀;Ⅳ，包括踝关节在内的全部足爪肿胀。AI值=四肢肢体关节肿胀级评分之和（Ⅰ级为1分，总分为16分）。AI≥4分为造模成功，本次成功率70%（于初次免疫12 d时造模成功）。

1.2.2  分组与干预  将造模成功的CIA大鼠随机分为CIA模型组、UA低剂量组、UA高剂量组、MTX组、UA+MTX组，每组各6只。在初次免疫12 d时，UA低剂量组给予每天50 mg/kg灌胃，UA高剂量组给予每天100 mg/kg灌胃，MTX组每3天给予1 mg/kg灌胃，UA+MTX组予以每天UA 50 mg/kg、每3天予以MTX 1 mg/kg灌胃，空白组和CIA模型组大鼠分别给予等体积生理盐水灌胃。每天观察大鼠进食、大小便、精神状态及一般活动情况。于初次免疫30 d断颈处死大鼠，四肢行X线摄片，再取下大鼠炎症的后足进行研究。

1.3  观察指标

1.3.1  关节炎X线评分[8]  X线评分从软组织肿胀、骨侵蚀和关节间隙改变3个方面综合进行评价。初次免疫30 d时将各组大鼠的四肢关节置X线成像系统下摄片（湖南中医药大学附属第一医院放射科）进行X线评分计分。

1.3.2  大鼠关节软组织中炎症相关分子IL-17A、IL-10、IL-6、TNF-α、IL-1β、TGF-β因子的mRNA表达检测  于初次免疫30 d，取大鼠炎症的后足，组织匀浆，按说明书提取各组RNA。使用Nanodrop2000检测RNA浓度及纯度，将浓度过高的RNA进行适当比例的稀释，使其终浓度为500 ng/μL。按照RT-RCR试剂盒说明书将RNA反转录合成cDNA，各引物序列见表1。取上述反应产物2.0 μLcDNA。配制如下反应体系，每个反转录产物配制3管：2×qPCR Mix

12.5 μL;上游引物2.0 μL;下游2.5 μL;ddH2O8.0 μL。

反应条件：预变性：95 ℃10 min;循环（40次）95 ℃15 s→60 ℃60 s;熔解曲线，65 ℃→95 ℃，每15秒升温0.3 ℃。在美国ABI7500荧光定量扩增仪上完成荧光实时监测PCR扩增，作出溶解曲线，收集荧光得到的曲线图，用实时荧光定量PCR分析程序分析。ΔΔCT法：A=CT（目的基因，待测样本）-CT（内标基因，待测样本），B=CT（目的基因，对照样本）-CT（内标基因，对照样本），K=A-B（mean），表达水平以2-ΔΔCT表示。

1.4  统计学处理

采用SPSS 19.0统计学分析软件进行数据处理，计量资料采用“x±s”表示，行方差齐性检验，组间比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1  UA 对CIA 大鼠的关节X线评分的影響

CIA模型组大鼠出现骨质疏松，足趾各关节空隙狭窄且模糊关节变形，关节X线评分增高。与空白组相比，CIA模型组大鼠关节X线评分明显增高（P<0.01）。与CIA模型组相比，UA高剂量组X线评分降低（P<0.05），MTX组、UA+MTX组大鼠关节X线评分明显降低（P<0.01）。与MTX组相比，UA低剂量组大鼠关节X线评分较高（P<0.05），见图1-2。

2.2  UA对CIA大鼠关节软组织炎症相关分子IL-17A、IL-10、IL-6、TNF-α、IL-1β、TGF-β因子的mRNA表达影响

与空白组相比，CIA模型组IL-6表达较高（P<0.05），IL-17A、TNF-α、IL-1β表达明显增高（P<0.01），抑炎因子TGF-β、IL-10表达明显降低（P<0.01）。与CIA模型组相比，UA低剂量组IL-17A、TNF-α、IL-1β降低（P<0.05）;UA高剂量组IL-6、IL-17A、TNF-α、IL-1β降低（P<0.05），抑炎因子TGF-β、IL-10表达升高（P<0.05）;MTX组IL-6、IL-1β表达降低（P<0.05），IL-17A、TNF-α表达明显降低（P<0.01），抑炎因子TGF-β升高（P<0.05）、IL-10明显升高（P<0.01）;UA+MTX组IL-6表达降低（P<0.05），IL-17A、TNF-α、IL-1β表达明显降低（P<0.01），IL-10表达升高（P<0.05），TGF-β明显升高（P<0.01）。与MTX相比，UA+MTX组TGF-β1表达升高（P<0.05），UA低剂量组IL-17A明显增高（P<0.01）。见表2。

3 讨论

RA临床表现为关节肿胀、疼痛、变形，滑膜持续炎症致骨骼破坏及软骨降解为特征[9]，炎症细胞因子激活破骨细胞是局部骨破坏的重要原因之一[10]。目前RA的致病原因尚未十分明确，故而无法采取针对性的根治措施。临床治疗的主要目标是缓解关节症状，控制病情进展，防止关节残疾的发生，从而改善生活质量，但无法做到根除。CIA模型能显示RA的慢性病变特征如关节滑膜增生、软骨和骨破坏，关节功能障碍，是研究人类RA的理想模型。课题组前期研究发现，UA能明显抑制体外T细胞激活与增殖[11]，降低Th17，升高Treg，维持Th17/Treg平衡[12-13]，UA体内给药100 mg/kg一周，明显减轻CIA大鼠关节的病理改变，减少大鼠关节中TNF-a、IL-17和PGE2的表达[14]。UA能明显抑制CIA大鼠关节肿胀程度，抑制关节滑膜组织增生，减轻关节的病理改变，改善骨质破坏[15]。

基于UA的抗炎、抗肿瘤、免疫调节等多种生物学活性。推测UA能够调节RA的免疫性炎症。本文复制CIA模型，研究UA对实验性RA大鼠关节炎症相关因子及关节X线评分影响，发现UA（100 mg/kg·d）给药能降低CIA关节X线综合评分，减少炎症因子IL-17A、IL-6、TNF-α、IL-1β因子的mRNA表达，升高抑炎因子IL-10、TGF-β因子的mRNA表达。MTX是目前治疗RA的基础性药物，其作用是抑制二氢叶酸还原酶以及甲酰基转移酶的活性，具有免疫抑制以及迅速的抗炎作用[16]。以MTX为基础的多种抗风湿药物的联合使用是临床研究的主要方向。UA来源广范，生物活性多，本实验研究表明UA可以改善CIA大鼠关节肿胀程度，缓解CIA大鼠关节炎症损伤，调节炎症因子在关节组织中的表达及改善关节X线评分，具有炎症的作用，作为一种有潜力的高效、低毒的中药炎症调节剂值得深入研究。

参考文献

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