复方ANBP对小鼠创面组织学变化的实验研究

陈丽 邢琴 周忠志 刘沐琳 陈港军 李利玲 李旺

〔摘要〕 目的 观察中药复方ANBP[由仙鹤草（Agrimonia Eupatoria， A）、 藕节（Nelumbo Nucifera Gaertn， N）、乳香（Boswellia Carteri， B） 和蒲黄（Pollen Typhae Angustifoliae， P）组成]对全层皮肤缺损小鼠创面愈合的影响，初步探讨复方ANBP对小鼠皮肤创面愈合的治疗机制。方法 将48只C57BL/6小鼠按照随机数字表法分为空白对照组、ANBP组，每组24只。采用全层打孔器制备小鼠背部全层皮肤缺损模型，每组再随机分为6 h、3 d、7 d、14 d 4个时间点。造模后空白对照组不做任何处理，ANBP组创面被覆复方ANBP粉末。通过肉眼和HE染色观察创面愈合情况并计算创面愈合率，对数据进行统计学分析。结果 （1）造模后3 d、7 d和14 d，与空白对照组相比，ANBP组创伤愈合率明显增加，差异具有统计学意义（P<0.05）;（2）HE染色结果显示ANBP组表皮舌长度增加、均匀平整，肉芽组织丰富。结论 复方ANBP可以明显改善小鼠创面情况，加快小鼠背部皮肤创面愈合速度，提高愈合质量。

〔关键词〕 中药复方;皮肤缺损;创面愈合;组织形态

〔中图分类号〕R264       〔文献标志码〕A       〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.06.005

〔Abstract〕 Objective To observe the effects of compound ANBP [（Agrimonia Eupatoria， A）， （Nelumbo Nucifera Gaertn， N）， （Boswellia Carteri， B） and （Pollen Typhae Angustifoliae， P）] on wound healing in mice with full-thickness skin defect， and preliminarily explore its related mechanism. Methods A total of 48 C57BL/6 mice were randomly divided into a blank control group and an ANBP group， with 24 mice in each group. And each group was also randomly divided into 4 time points of 6 h， 3 d， 7 d and 14 d to prepare the full-thickness skin defect model of mouse back by full-layer puncher. No treatment was given to the blank control group after modeling， and the wound was covered with compound ANBP powder in the ANBP group. The wound healing was observed by naked eye and HE staining and the wound healing rate was calculated. Also， the data were statistically analyzed. Results （1） Compared with the blank control group， the wound healing rate in the ANBP group was significantly increased after 3 d， 7 d and 14 d of the modeling， and the difference was statistically significant （P<0.05）; （2） HE staining showed that the length of epidermal tongue was increased， even and flat， with abundant granulation tissue. Conclusion Compound ANBP can significantly improve the wound condition in mice， accelerate the healing speed of the skin wound on the mouse back， and improve the healing quality.

〔Keywords〕 Chinese compound formula; full-thickness skin defect; wound healing; histomorphology

創伤和意外伤害是导致死亡、降低生活与工作质量的重要原因。伤后创面经常出现修复不足的慢性溃疡现象，严重影响患者的生活和工作[1-3]。如何促进创面愈合成为皮肤损伤组织修复与再生的关键问题。目前，应用多种细胞因子、干细胞作为种子细胞，修复受损皮肤，促进创面愈合，但难以有效用于临床或临床效果不佳[4-8]。

本课题组采用中药复方ANBP微粉在临床上治疗皮肤组织创伤有一定的疗效。ANBP由仙鹤草（Agrimonia Eupatoria，A）、 藕节（Nelumbo Nucifera Gaertn， N）、乳香（Boswellia Carteri，B）和蒲黄（Pollen Typhae Angustifoliae，P）4味经典的治疗创伤的中药，按君臣佐使原则配伍构成，具有止血止痛、消炎凉血、活血生肌的功效[9-10]，但具体机制尚不明确。本实验是从形态学角度观察复方ANBP对C57BL/6小鼠创面愈合的作用，探讨其疗效和作用机制，现将结果报道如下。

1 材料

1.1  实验动物

C57BL/6小鼠48只，鼠龄7周，雌性，SPF级，体质量（20±2）g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司;实验操作过程中对动物的处置符合2009年《Ethical Issues in Animal Experimentation》中关于动物伦理学标准的条例。

1.2  实验药物

复方ANBP，由仙鹤草、藕节、乳香和蒲黄4味中药组成，由湖南中医药大学第一附属医院制剂室提供，药物制备方法参考本课题组已发表论文[9]。

2 方法

2.1  动物造模及分组

小鼠适应环境3 d后，随机分为2组：空白对照组24只、ANBP组24只。两组小鼠再随机分为4个时间点，每组6只。将实验器械均消毒完毕后开始脱毛、备皮（选定创伤造模范围及大小，在其背部使用弯剪进行基础脱毛后，使用少量无刺激性脱毛膏脱毛2～3 min，最后用无菌棉签将脱毛膏和残存毛发处理干净）、消毒（将脱毛后的皮肤区域依此使用碘酒及酒精），消毒完毕后用直径1 cm的全层打孔器在小鼠背部制成全层皮肤缺损模型[11]。造模后，空白对照组不做处理，ANBP组的小鼠创面上立即均匀被覆上一层中药复方ANBP粉末。

2.2  标本采集

造模后6 h、3 d、7 d、14 d，取空白对照组和ANBP组4个时间点造模的小鼠，用10%水合氯醛麻醉，对创面进行拍照记录。取相同部位以创面为中心、深至骨组织的大小为2 cm×2 cm标本（能确保修剪标本时保留创伤后新生组织），于4%多聚甲醛的瓶中固定，常温保存。

2.3  小鼠创面肉眼观察

观察并记录两组小鼠不同时间点的愈合情况，测量各时间点的小鼠创面直径，并利用Image Pro Plus计算出各时间点小鼠背部创面愈合面积。

创面愈合率=（原始创面面积-检查时创面面积）/原始创面面积×100%。

2.4  小鼠创面组织病理观察

将固定在4%多聚甲醛中的标本送至湖南中医药大学显微形态实验室，经脱钙液脱钙（5%硝酸处理5～7 d），经75%、85%、90%、95%乙醇及无水乙醇脱水，放入二甲苯透明，浸蜡包埋，切片机（厂家：LEICA;型号：RM2235）进行切片，37 ℃摊片，捞片，按顺序装篮，60 ℃的恒温箱内烤片，烤片2 h。脱蜡前放在70 ℃烤箱里加热30 min，行HE染色。

2.5  统计学处理

采用SPSS 22.0统计软件进行数据处理，计量资料以“x±s”表示，两个样本间比较方差齐性采用独立样本t检验，方差不齐则采用Mann-Whitney U秩和检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1  小鼠创面愈合不同时间点的肉眼观察

空白对照组：造模后6 h创缘内翻、肿胀，创面湿润、色泽偏亮、颜色偏淡，创缘交界处存在出血点;造模后3 d创缘凸起明显，创面干燥、质硬，痂皮较薄;造模后7 d可见大片较厚痂皮，质硬，边缘不规则;造模后14 d创缘出现新生毛发，创面仍未愈合，存在痂皮。ANBP组与空白对照组相比，造模后6 h创缘无明显水肿、出血，创面干燥;造模后3 d可见创缘规则平整，创面色泽红润，质软，创面面积缩小;造模后7 d创缘可见新生表皮，创面与创缘平齐，创面面积进一步缩小;造模后14 d原創面完全愈合，皮肤平整，质软，周边毛发生长良好（见图1）。与空白对照组比较，ANBP组在造模后14 d的创面平均直径的差异具有统计学意义（P<0.05），见表1。

3.2  复方ANBP对小鼠创面愈合率的影响

造模后3 d、7 d、14 d，与空白对照组相比，ANBP组小鼠创面面积缩小显著，差异具有统计学意义（P<0.05）。具体见表2。

3.3  小鼠背部创面不同时间点的组织病理学观察

造模后6 h：空白对照组创缘皮肤各层水肿变性坏死明显，深筋膜层结缔组织水肿疏松，厚薄不一，少量炎细胞浸润;创面深筋膜层层次紊乱不连续，未解离膨胀较薄，肌层肌细胞水肿变性坏死，肌纤维松解，肌膜内有明显充血;创缘表皮与深筋膜之间角度较大，见图2A-2D。与空白对照组相比，ANBP组创缘皮肤各层水肿变性坏死程度轻微，深筋膜层无明显水肿，厚薄均匀，炎细胞浸润明显;创面深筋膜层结构完整连续，解离膨胀较厚，层次增多，血管扩张明显;创缘的表皮与深筋膜之间角度明显变小，见图2E-2H。

造模后3 d：空白对照组创缘表皮层细胞数量增多，层次增厚，往创面增殖迁移，表皮舌厚薄不均，与创面垂直，创缘成纤维细胞和毛细血管少量增生，肉芽组织少，创缘痂块松散易碎;创面大量炎性细胞浸润，见图3A、3B。与空白对照组相比，ANBP组创缘表皮舌厚度均一，与创面相平，长度更长，创缘成纤维细胞和毛细血管增生明显，肉芽组织丰富，创缘痂块紧密;创面胶原纤维增生明显，见图3C、3D。 造模后7 d：空白对照组创缘表皮层细胞大量增殖，尚未成熟，层次不清，厚薄不匀，表皮下有大量新生毛细血管，肉芽组织丰富，见图4A、4B;与空白对照组相比，ANBP组创缘表皮层细胞成熟，层次清晰，厚薄较均一，出现新生毛囊，表皮下出现成纤维细胞和胶原纤维，毛细血管较少，真皮层结构趋向成熟，见图4C、4D。

造模后14 d：空白对照组创面已经完全表皮化，部分新生的表皮层较厚，无毛囊、皮脂腺等附属器，其下真皮成纤维细胞和胶原纤维致密，部分新生的表皮层较薄，其下真皮成纤维细胞和胶原纤维较致密，有大量未成熟的毛囊、皮脂腺等附属器，未见皮肤肌层结构，见图5A-5D;与空白对照组相比，ANBP组创面新生的表皮层较成熟，厚度均一，其下真皮成纤维细胞和胶原纤维减少，组织疏松，有毛囊、皮脂腺、竖毛肌等附属器，真皮层较成熟，可见皮下组织结构，浅筋膜层血管丰富，可见皮肤肌层结构，见图5E-5G。

4 讨论

创面修复的过程可以分为四个时期，即止血期、炎症反应期、增殖期、塑形期[12-16]。复方ANBP是本课题组临床上治疗创伤愈合的经验药方。本实验肉眼观察显示，ANBP组与空白对照组相比，造模后6 h减轻创缘水肿、出血，造模后3 d可见创缘规则平整，创面色泽红润，创面面积缩小，造模后7 d创缘可见新生表皮，创面与创缘平齐，创面面积进一步缩小，造模后14 d原创面完全愈合，皮肤平整，质软，周边毛发生长良好。ANBP可以显著提高在造模后3 d至14 d的愈合率，以上结果提示：复方ANBP可以加快小鼠创面愈合速度。

在创伤早期及时处理，迅速止血止痛，可以减少组织损伤，从而避免机体产生过强的防御反应，在一定程度上减少炎症反应，有利于创伤快速愈合，及早完成一期愈合。本实验组织病理学结果显示，造模后6 h，空白对照组创缘组织明显变性水肿坏死，而ANBP组创面干燥无明显出血水肿变性坏死，说明复方ANBP在创伤早期可以迅速止血，减轻组织损伤;造模后3 d，空白对照组炎细胞浸润明显，而ANBP组出现丰富肉芽组织，表皮舌长度明显增加，说明造模后3 d空白对照组仍处于炎症反应期，ANBP组已进入增殖期;造模后7 d，空白对照组表皮下有大量新生毛细血管，肉芽组织丰富，而ANBP组创缘表皮层及真皮层结构比较成熟，层次清晰，出现新生毛囊，说明造模后7 d空白对照组仍处于增殖期，而ANBP组已进入塑形期;造模后14 d，空白对照组新生的表皮层厚薄不均，无毛囊、皮脂腺等附属器，真皮成纤维细胞和胶原纤维致密，不成熟，而ANBP组创面新生的表皮层和真皮层较成熟，层次清晰，厚度均一，有毛囊、皮脂腺、竖毛肌等附属器。以上结果说明，复方ANBP可以提高创面愈合质量。

本实验通过建立小鼠背部全层皮肤缺损模型，观察创面愈合情况，运用复方ANBP达到减轻创伤早期损伤和炎症反应，加快肉芽组织增生和再表皮化速度，加速创伤愈合的进程，提高创伤愈合质量。复方ANBP对小鼠皮肤创面愈合的治疗机制有待进一步验证。

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