基于SSR分子标记的紫斑百合和栽培百合亲缘关系研究

陈庭见智　袁文斌　吴景芝　王玉英　吴红芝

摘要：【目的】分析紫斑百合與栽培百合的亲缘关系，为利用紫斑百合改良栽培百合杂交育种中亲本的选配提供指导。【方法】以6份紫斑百合野生资源和92份市场流行、广泛栽培的百合品种为材料，通过两轮温度梯度PCR筛选引物后，利用SSR引物对DNA进行PCR扩增，并进行UPGMA聚类分析。【结果】从100对SSR引物共筛选获得15对通用性好、多态性高、扩增条带清晰的引物。15对SSR引物在98份百合样品中共检测到93.0个等位位点，平均每对引物6.2个。多态性信息含量（PIC）为0.29～0.84，平均为0.66，其中PIC高于0.50的引物有13对，属于高多态性引物。UPGMA聚类分析结果显示，98份样品聚为两大分支，分支Ⅰ包括紫斑百合、O（东方百合）杂种系和OT杂种系，表明其遗传关系较近，筛选的15对SSR引物可将这3个类群进行有效区分;分支Ⅱ包括LA杂种系、L（麝香百合）杂种系和A（亚洲百合）杂种系，不同的类群间有部分交叉，筛选的15对引物不能对其进行有效区分。【结论】筛选出的15对SSR引物可将98份百合材料分为两大分支，并可应用于分支Ⅰ中3个类群的分子鉴定。紫斑百合与OT杂种系和O杂种系的遗传关系更近，在制定紫斑百合与栽培百合杂交组合时可先从OT杂种系和O杂种系的杂交改良展开研究，特别是聚在紫斑百合附近的优良OT百合品种。

关键词： 紫斑百合;栽培百合;SSR分子标记;亲缘关系;杂交育种;聚类分析

中图分类号： S644.1                          文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）12-2647-09

Phylogenetic relationship between Lilium nepalense and cultivated lilies based on SSR molecular markers

CHEN Ting-jian-zhi， YUAN Wen-bin， WU Jing-zhi， WANG Yu-ying， WU Hong-zhi*

（College of Horticulture and Landscape， Yunnan Agricultural University， Kunming  650201， China）

Abstract：【Objective】The purpose of this study was to explore the genetic relationships between Lilium nepalense and cultivated lilies to provide reference for improving parent breeding in the hybrids of cultivated lilies improved by L. nepalense. 【Method】A total of 6 wild L. nepalenses and 92 cultivars with market interests were analyzed in this study. SSR primer pairs were screened for polymorphism in two rounds of temperature gradient PCR. Following all samples were amplified by selected SSR primers， UPGMA cluster was performed. 【Result】There were 15 SSR primer pairs with good versatility， high polymorphism and clear amplification bands being screened from 100 pairs of SSR orimers. A total of 93 allelic loci were detected in 15 primer pairs among the 98 lily samples， with an average of 6.20 alleles of every pri-mer pair. The variation range of polymorphism information content（PIC） was 0.29-0.84， with an average value of 0.66， and PIC of 13 primer pairs was higher than 0.50， which were high polymorphism primers. UPGMA cluster analysis showed that 98 samples were divided into two main branches. BranchⅠ included L.nepalense， O（Oriental） hybrids and OT hybrids， indicating that their phylogenetic relationships was closely related， and three groups could be distinguished effectively by the selected 15 primer pairs. Branch Ⅱ included LA hybrids， L（Easter） hybrids and A （Asia） hybrids. But there were overlaps among the groups， the 15 SSR primer pairs could not classified them effectively. 【Conclusion】The selected 15 SSR primer pairs can divide 98 lily samples into two main branches， and can be applied to molecular identification of three groups in branch Ⅰ. L. nepalense has a closer relationship with O hybrids and OT hybrids. When making a crossbreeding program between L. nepalense and cultivated lilies， O hybrids and OT hybrids can be given a priority to cross with L. nepalense， especially the excellent OT hybrids， which are clustered around L. nepalense.

Key words： Lilium nepalense; cultivated lily; SSR molecular markers; phylogenetic relationship; crossbreeding; cluster analysis

0 引言

【研究意义】百合是我国的传统名花，寓意美好，深受人们喜爱，也是目前居世界第二的切花。现代栽培观赏百合主要由杂交选育而来，具有较高的经济和美学价值（郭志刚和张伟，2001），但现代栽培百合尚缺乏许多优良性状，如缺乏绿花、清香味和抗性等。我国拥有丰富的百合资源，原产47种，约占世界百合资源的一半，是现代栽培百合的重要亲本源（吴征镒等，1997;龙雅宜和张金政，1998;梁振旭，2014）。紫斑百合为百合科（Liliaceae）百合属（Lilium）植物，花淡黄绿色至淡绿色，花瓣中至底部有紫色斑点，花被反卷如喇叭状，花朵大而多，气味清幽淡雅，生长强健，是最具开发利用价值的野生百合之一（何显静等，2003;李标等，2004;吴学尉等，2006）。鉴于紫斑百合的优良性状及其蕴藏的巨大育种价值，探究紫斑百合与栽培百合间的亲缘关系，对制定紫斑百合与栽培百合杂交组合，利用紫斑百合改良栽培百合具有重要指导意义。【前人研究进展】我国野生百合主要分为卷瓣组、钟花组、百合组和轮叶组，而紫斑百合同时兼具卷瓣组和轮叶组的特征。在亲缘关系不清基础上盲目选择亲本杂交，经常会导致杂交不亲和或杂交后代不育（赵祥云等，1994;张克中等，2008;郭朋辉等，2019）及时间和种质材料的浪费。分子标记在百合的种质鉴定、亲缘关系、遗传多样性及系统进化方面得到广泛应用，是百合种质资源保护和新品培育的重要手段（张云等，2001;罗凤霞等，2008;侯珺等，2016;赵玉倩等，2016）。赵祥云等（1995）运用RAPD分子标记评价了14个百合品种（含13个栽培种和1个野生种）间的遗传关系;左志锐等（2005）对60个百合野生种及栽培品种进行了RAPD分析;王洁琼（2006）调查和收集了云南、陕西和吉林长白山部分地区的50份百合资源，并采用AFLP和cpSSR两种分子标记对百合资源的遗传多样性进行研究;陈琼等（2007）以百合两个杂交组合（Brunello×Yellow Jiant和Prato×Lilium pumilum）的亲本和杂交后代为试验材料，采用4对多态性高的SRAP引物进行分析，证实杂交后代的真实性及遗传偏向;崔光芬等（2008）以滇蜀豹子花和多斑豹子花为材料，测定其ITS序列，结合GenBank中其他3种豹子花和5种百合的ITS序列构建了系统发育进化树。SSR（Simple sequence repeats）与其他分子标记相比，具有在染色体上分布均匀、多态性丰富、共显性遗传和易于检测等优点（Devarumath et al.，2002）。基于ABI 3730XL遗传分析仪（Applied Biosystems Sequence Analyzer）的SSR荧光标记毛细管电泳技术使扩增产物长度的检测更精确，误差通常在1 bp内，不同荧光标记产物相互混合同时检测，实验效率极大提高（Shirasawa et al.，2011），目前已广泛应用于各种材料的研究，如水稻（程本义等，2011）、银杏（王星星等，2017）、花菜（刘春晴等，2018）和茶花（陶乃奇等，2019）等。近年来，在百合中也开发出了许多稳定性好和多态性高的SSR分子标记。杨素丽等（2008）、Lee等（2011）依据NCBI数据库中已知的EST（Expressed sequence tags）序列信息检索含有SSR的序列，以此开发新的分子标记;葛亮等（2012）、Yuan等（2013）利用岷江百合（L. regale）转录组数据开发了EST-SSR分子标记;杜方（2014）分析百合鳞茎、叶片和花朵的表达谱数据库，开发了61对SSR引物。【本研究切入点】分子标记在百合种质鉴定、亲缘关系、遗传多样性和系统进化方面已有较多研究，但利用分子标记分析紫斑百合与栽培百合间亲缘关系的研究尚无报道。【拟解决的关键问题】利用SSR分子标记对云南地区野生紫斑百合与目前市场流行和广泛栽培的东方百合（O）杂种系、OT杂种系、亚洲百合（A）杂种系、麝香百合（L）杂种系和LA杂种系的亲缘关系进行研究，以期为利用紫斑百合改良栽培百合杂交育种中亲本的选配提供指导，以减少栽培百合杂交育种的盲目性，提高育种效率。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

试验于2017年6月—2018年12月进行。试验用百合材料种植于云南农业大学园林园艺学院温室，SSR分子标记试验在中国科学院昆明植物研究所进行。试验材料共98份，其中包括6份紫斑百合、17份东方百合（O）杂种系、20份OT杂种系、7份亚洲百合（A）杂种系、3份麝香百合（L）杂种系和45份LA杂种系。材料详细信息见表1。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 DNA提取 选取新鲜的百合嫩叶，采用CTAB法提取总DNA，提取的DNA经TE Buffer溶解后加入2.0 µL RNA酶37 ℃消化2 h，并用1%琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop ND-1000对质量进行检测，检测后如有DNA质量不达标，对其进行重新提取。最后将质量合格的DNA浓度稀释至30 ng/µL，4 ℃下保存备用。

1. 2. 2 引物和退火温度筛选 试验所用的100对百合SSR引物，其中有57对是利用Primer 5.0对NCBI数据库中百合EST序列设计获得，43对是从前人的研究报道中（葛亮等，2012;Yuan et al.，2013;杜方，2014;赵玉倩等，2016）选取，引物由昆明硕擎生物技术有限公司合成。设置温度梯度对引物退火温度进行筛选，温度范围为50～65 ℃，梯度为1 ℃，PCR在Applied Biosystems Veriti PCR仪上进行。反应体系20.0 µL：10.0 µL 2×Taq PCR MasterMix[天根生化科技（北京）有限公司]，正、反向引物各0.5 µL（5 µmol/L），1.0 µL DNA模板，8.0 µL ddH2O。扩增程序：94 ℃预变性2 min;94 ℃ 30 s，50～65 ℃退火35 s，72 ℃ 45 s，进行35个循环;72 ℃延伸7 min;4 ℃保存。聚丙烯酰氨凝胶电泳中PCR产物上样量2.0 µL，分子量标准100 bp DNA Ladder上樣量1.0 µL，220 V电压下电泳1.5 h，经固定、银染、脱色和显影4个步骤后对检测结果拍照保存以便进行下一步分析。

1. 2. 3 SSR荧光标记毛细管电泳检测 筛选的引物由硕擎生物公司合成荧光引物，荧光标记PCR反应体系和扩增程序与引物筛选时一致，按PCR产物1.0 μL，片段大小标准 GS500（-250）LIZ 0.1 μL和高度去离子甲酰胺（HiDi）8.9 μL，充分混匀，置于PCR仪中95 ℃变性5 min后迅速冰浴2 min，最后在ABI3730xl遗传分析仪上进行毛细管电泳检测，运用GeneMarker对上机结果进行片段读取及基因分型分析。

1. 2. 4 SSR引物多态性分析 毛细管电泳结果采用“0-1”系统进行谱带位置记录，样品在某一扩增长度位点处有峰值出现记作“1”，代表该样品在此SSR位点处出现对应长度的扩增片段，无峰值出现记作“0”，代表该样品在此位点无扩增片段，结果采用Excel 2003记录保存。基于98份百合样品的SSR扩增结果计算每对引物的等位基因数和多态性信息含量（PIC），对引物的多态性进行评价。PIC利用公式PIC=1-[inP2i]进行计算，式中，Pi表示第i个等位基因出现的频率，当PIC>0.50为高多态性引物，0.25<PIC≤0.50为中多态性引物，PIC≤0.25为低多态性引物。

1. 2. 5 UPGAM聚类分析 毛细管电泳统计的98份百合样品（0，1）矩阵，根据Gower（1971）、Podani（1999）提出的方法，使用R语言包对样品间的遗传距离进行计算，采用MEGA 7.0构建UPGAM系统发生树。

2 结果与分析

2. 1 DNA提取结果

98份百合样品DNA经NanoDrop ND-1000检测，浓度均在50 ng/µL以上。以分子量标准100 bp DNA Ladder（M）为对照，经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，结果（图1）显示大部分DNA在23130 bp处条带清晰明亮，有明显的主带，个别样品（ct63、ct65、c78和ct84）发生轻微降解，DNA总体质量符合SSR-PCR扩增要求。

2. 2 SSR引物筛选

采用12份样品和温度梯度对100对引物进行筛选，初步筛选出26对多态性较好的引物。选取24份样品再次对初筛引物进行第二轮筛选，最终确定15对通用性好、扩增条带清晰、多态性高和杂带少的SSR引物。部分SSR引物扩增产物的聚丙烯酰氨凝胶电泳结果见图2，筛选出的15对引物名称、序列和最适退火温度见表2。

2. 3 扩增片段大小和等位基因数目

采用15对荧光引物分别对98份百合材料进行扩增，荧光引物在正向引物的5'端添加荧光染料fam（蓝色）或hex（绿色），扩增得到的片段长度为90～300 bp。不同引物等位基因数2.0～10.0个，15对SSR引物共检测到93.0个等位基因，每对引物平均6.2个，其中引物C-15的等位基因数最多，为10个，引物C-18最少，为2.0个。引物C-16在Party Diamond、Corvara和Trogon的扩增带型见图3，各引物荧光标记种类、扩增片段大小和等位基因数见表3。

2. 4 多态性分析结果

PIC用于评价每个SSR分子标记用于群体检测多态性的价值，某个位点出现等位基因数目越多，各等位基因频率越平等，PIC越高。由表3可知，15对SSR引物的PIC变化范围为0.29～0.84，平均为0.66，其中引物C-15和C-a15的PIC最高，为0.84，引物C-a46的PIC最低，为0.29。15对SSR引物中PIC高于0.50的有13对，属于高多态性位点引物，具有很好的群体遗传多样性鉴别能力，其余2对引物属于中度多态性引物，表明筛选的15对SSR引物多态位点变异性好，多态性鉴别能力高。

2. 5 UPGMA聚类分析结果

根据样品间的遗传距离，利用MEGA 7.0绘制UPGMA系统发生树。结果（图4）显示，98份百合样品聚为两大分支：分支Ⅰ以紫斑百合、OT杂种系和O杂种系为主，3个类群分别聚为一支，筛选的15对SSR引物可将各类群进行有效区分。紫斑百合先与OT杂种系聚在一起，再与O杂种系共同构成分支Ⅰ，表明其遗传关系较近。分支Ⅱ以LA杂种系、L杂种系和A杂种系为主，3个杂种系没有明显地各自聚为一支，LA杂种系分散在整个分支Ⅱ中，A杂种系和L杂种系则聚在分支Ⅱ靠近基部位置，3个种系间可能进行过频繁的基因交流，筛选的15对SSR引物无法将其进行有效区分。

3 讨论

紫斑百合具有商业品种中缺乏的绿花性状，花朵大而多，气味清幽淡雅，生长适应性强，是最具开发利用价值的野生百合之一（吴学尉等，2006;郭朋辉等，2019）。本研究中的92份栽培百合资源是目前市场上流行、广泛栽培且综合性状好、商业性状突出的品种，研究紫斑百合与这些栽培百合的亲缘关系，对利用紫斑百合改良栽培百合，培育出具有市场价值的商业品种具有重要指导意义。

从多态性结果来看，本研究筛选的15个SSR分子标记在98份百合样品中表现出较高的多态性水平，平均等位基因数6.2个，高于葛亮等（2012）的3.47个、Yuan等（2013）的2.97个、钟程等（2015）的1.69个，平均PIC为0.66，高于葛亮等（2012）的0.55和Yuan等（2013）的0.494，平均等位基因数和平均PIC均是已知报道中最高的。本研究在选择百合样本时考虑其种系归属，避免了种系过于单一或同一种系样品过于集中对多态性结果造成的影响。本研究用于百合资源鉴定的15对SSR引物是通过两轮筛选获得，较只经过一轮筛选的引物通用性更好，多态性更高，扩增条带更清晰。多态性条带检测采用荧光毛细管电泳方法，检测结果比传统的聚丙烯酰胺凝胶电泳方法更精确，也避免了人为主观因素带来的影响。

本研究的98份百合材料分别归属于5个杂种系和1个原生种，聚類分析结果与已知的分类关系基本一致。杜方（2014）通过SSR对32份百合材料进行聚类分析，发现32个样品聚为G1和G2两个大组，G1包括A杂种系、L杂种系、LA杂种系和7个原生种，其中7个原生种曾参与A杂种系的形成，G2包括O和OT和1个原生种，该原生种曾是O类百合的杂交亲本，与本研究得到的结果类似。本研究的UPGMA聚类分析结果表明，分支Ⅰ中紫斑百合与OT系和O杂种系遗传关系更近，在发掘利用紫斑百合优良性状时可优先考虑与OT杂种系和O杂种系杂交，特别是聚在紫斑百合附近的优良OT百合品种;但在分支Ⅱ中3个杂种系未明显地聚为一支，有部分交叉，可能是筛选出的15对SSR引物无法将其进行有效区分，需开发新的SSR分子标记，或与SNP分子标记（郑司浩等，2014）、AFLP分子标记（Hir，2016）及表型（段青等，2018）等相结合作更进一步的分析。本研究的百合栽培品种资源是从目前市场流行的主栽品种中收集而来，可收集的资源种类和数量受市场选择的影响，供试的92份栽培百合品种中，有20份OT杂种系、17份O杂种系、7份A杂种系、3份L杂种系和45份LA杂种系，各类群数量不均匀，类群还不够丰富，缺乏T、OA、LO和LT等类群，同时野生紫斑百合资源也受生境破坏的严重影响，数量越来越少，未来的工作中将尽可能多地收集资源以丰富样本库。

4 结论

从100对SSR引物中筛选出通用性好、扩增条带清晰和多态性高的15对SSR引物，筛选出的15对SSR引物可将98份百合材料分为两大分支，并可应用于分支Ⅰ中3个类群（紫斑百合、OT杂种系和O杂种系）的分子鉴定。紫斑百合与OT杂种系和O杂种系的遗传关系更近，在制定紫斑百合与栽培百合杂交组合时可先从OT杂种系和O杂种系的杂交改良展开研究，特别是聚在紫斑百合附近的优良OT百合品种。

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（責任编辑 麻小燕）