从叶绿体DNA角度分析云南省砂梨地方品种遗传多样性

齐丹+曹玉芬+田路明+董星光+张莹+霍宏亮+常耀军

摘要：探讨云南地区砂梨种質资源的遗传背景，选用4对呈现多态性的叶绿体引物，对19个原产于云南省的砂梨品种和3个对照品种的trnL-trnF、rbcL、trnS-psbC区域进行扩增。结果表明：4对引物的扩增结果合并后得到长度为3 831 bp叶绿体基因片段，含有4个单倍型（H1～H4）、14个多态性位点，其中单一突变位点11个，简约信息性位点3个，插入/缺失（InDel）1个。19份砂梨种质的单倍型（基因）多样性（Hd）、核苷酸多样性（Pi）分别为0.602、0.000 38。合并后的片段经Tajimas D检验其D值基本未达显著水平，遵循中性模型。4个叶绿体单倍型的中介网络显示：单倍型H1与H2、H3的亲缘关系较近，而H4则与上述3个单倍型的亲缘关系较远。经叶绿体单倍型分析可知，云南砂梨地方品种的遗传多样性较为丰富。

关键词：砂梨；叶绿体DNA；遗传多样性；亲缘关系

中图分类号： S661.203.2文献标志码：

文章编号：1002-1302（2016）08-0209-03

云南省位于我国西南地区，其西北部为横断山脉区，东南部为云贵高原，地形地貌复杂，植物种质资源丰富，是中国梨的起源地之一，原产梨种质资源有川梨（Pyrus pashia Buch-Ham.）、砂梨（P.pyrifolia Nakai.）、滇梨（P.pseudopashia Yü.）、豆梨（P.calleryana Dcne.），其中砂梨是云南省地方栽培梨品种的主体，分布于云南省大部分地区，地方优良品种诸多，如宝珠梨、巍山红雪梨、富源黄皮梨、火把梨等[1]。了解地方品种的遗传多样性和亲缘关系，对揭示云南省砂梨资源的起源、保护及利用有重要意义。

DNA分子标记技术，如RAPD、AFLP、SSR、IRAP等，已经广泛应用在果树植物遗传多样性、品种鉴定、亲缘关系等研究领域[2-5]。叶绿体DNA（cpDNA）在大多数被子植物中属母系遗传，分子较小、高拷贝、结构简单、保守性强，且没有或很少经历重组，其中的非编码区域变异丰富，适于进行低分类阶元系统起源、发育和进化研究[6]。cpDNA非编码区序列在梨属植物的野生群体和栽培品种的群体结构、系统发生地理学、进化、遗传多样性研究上都有应用[7-13]。本研究从母系遗传的角度出发，对叶绿体非编码区trnL-trnF，trnS-psbC和rbcL区域进行扩增，分析云南省砂梨资源的亲缘关系和遗传多样性。

1材料与方法

1.1材料

19份中国砂梨、2份日本砂梨（丰水、长十郎）、1份川梨（酸罐梨）来自辽宁省兴城市中国农业科学院果树研究所国家果树种质兴城梨、苹果圃。所有材料（表1）的叶片经液氮处理后保存于-70 ℃冰箱备用。

1.2方法

使用QIGEN试剂盒方法提取总DNA，4对叶绿体通用引物参照常耀军等的试验结果[14][生工生物工程（上海）股份有限公司合成]。对22份材料进行PCR扩增，对扩增产物进行2%琼脂糖凝胶检测，得到清晰的特异性条带后，纯化后交上海美吉生物医药科技有限公司（北京）测序。

2结果与分析

2.1变异位点鉴别和cpDNA单倍型多样性

本试验所用4对引物扩增所涉及的叶绿体DNA序列分别是trnL-trnF（P2、P3）、trnS-psbC（P9）、rbcL（CP03），其中P2、P3引物扩增的是trnL-trnF序列的不同区域。通过MEGA 5.2软件对测序结果进行序列排比，并进行人工校正，序列长度分别为561 bp（trnL-trnF，P2）、448 bp（trnL-trnF，P3）、1 537 bp（trnS-psbC，P9）、1 285 bp（rbcL，CP03），合并后的长度为3 831 bp；多态性位点14个，其中单一突变位点11个，简约信息性位点3个，8 bp（TCAATTAG）的碱基插入/缺失（InDel）1个（表2）。

2.2单倍型的中介网络图的构建

利用软件NetWork ver 4.6.1.2，采用中介邻接网络算法和最大简约算法分别计算和优化结果，构建试验材料4个 cpDNA 单倍型间的关联图，其中单倍型、中介矢量载体的名称分别为HAP、mv，结果见图1。21个砂梨品种存在3种单倍型：HAP_1、HAP_2、HAP_3，3种单倍型包含的品种数目分别为5、5、11个，2个日本砂梨品种丰水和长十郎及昆明麻、秋白砂、野生砂梨同为H2。川梨品种酸罐梨独有单倍型H4，与其他砂梨品种相比，在trnL-trnF-448区域（P3）中，有长达8 bp的碱基插入-缺失片段（TCAATTAG）。图1显示HAP_2包含HAP_3，位于中介网络图的躯干上，说明HAP_2和HAP_3的分化时间要早。HAP_1和HAP_2由mv1连接，HAP_2和HAP_4由mv2连接。在变异位点上，HAP_2和HAP_3有1个差异，HAP_1和HAP_2有1个差异，HAP_1和HAP_3有2个差异，HAP_4和HAP_2有13个差异，且含有8 bp （TCAATTAG）的碱基插入-缺失片段。

3讨论与结论

单倍型H1的5个品种巴克斯、花红、水汁梨、海东和牛头的原产地位于滇西北地区。滇西北丽江梨区为横断山脉的一部分，立体地形复杂，属于高原气候[15]。推测单倍型H1的品种起源于该地区，由于地理隔离导致的生殖隔离，使其单独聚为1组，该情况与贵州砂梨种质资源遗传多样性的ISSR分析结果相似[16]。单倍型H2、H3的品种分布范围较广泛，其中原产云南的品种除滇西北地区以外均有分布，单倍型多样性体现了地理分布特点。来自日本的砂梨品种长十郎、丰水及野生砂梨、昆明麻、秋白砂同为H2，日本砂梨在日本没有发现，野生种，也没有相关的记载[17]，从叶绿体母系遗传的角度分析其母系祖先可能同为野生砂梨。沈玉英等在用RAPD分析部分中国砂梨和和日本梨的研究中发现，秋白砂梨与长十郎显示最高的相似系数[18]，本研究中秋白砂梨与长十郎的单倍型相同，从母系遗传角度说明二者的亲缘关系很近。

这些不同类型的变异组成了4种不同類型的单倍型，单倍型多样性Hd为0.675，其中云南省地方砂梨品种的Hd值为0.602，与辽宁省地方梨品种的0.577相比稍高[14]，由于研究所用的引物相同，推测云南省梨种质资源多样性更为丰富，低于福建省地方砂梨品种的Hd值0.660[19]、浙江省野生豆梨群体的Hd值0.719[8]和云南省野生川梨的Hd值 0.718[9]，分析其主要原因在于所选用的引物不同以及野生群体表现出更强的遗传多样性。

川梨起源于中国西南地区和喜马拉雅山区，因此被视为东方梨和西方梨之间的过渡种[9]，本研究所选用的对照品种酸罐梨为原产于云南省的川梨品种。对测序结果进行分析发现，在trnL-trnF-448区域（P3）中，有长达8 bp的碱基插入（InDel），而在云南砂梨品种和日本砂梨品种中这段序列缺失，为川梨品种酸罐梨独有，表明InDel作为1次突变事件，可用于系统发育分析，为阐明梨属植物种间关系提供了重要信息来源[20-21]。云南地区的梨属种质资源丰富，建议加强对云南省地方梨栽培品种和野生种的保护和利用，丰富梨育种基因库。

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