补阳还五汤对大鼠全脑缺血再灌注L型Ca2+通道平均开放时间的影响

梁逸仙　周光辉　廖仲波　赵青　周锐钧　张继平　秦曼妮

[摘要] 目的 探討补阳还五汤对大鼠全脑缺血再灌注L型Ca2+通道平均开放时间的影响。 方法 应用四血管闭塞法制备全脑缺血再灌注大鼠62只，采用随机数字表法将其分为对照组和研究组，每组各31只。对照组应用生理盐水灌服，研究组应用补阳还五汤水煎液灌服。在处理后2、12、24、48、72 h五个时间点进行观察。比较两组大鼠不同时间点L型Ca2+通道平均开放时间、脑组织含水量、血清超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）含量。 结果 研究组大鼠不同时间点L型Ca2+通道平均开放时间明显短于对照组（P < 0.05）;与本组再灌注72 h比较，两组其余各时间点L型Ca2+通道平均开放时间差异有统计学意义（P < 0.05）。缺血再灌注处理后研究组大鼠脑组织含水量也明显低于对照组（P < 0.05），与本组再灌注72 h比较，两组其余各时间点脑组织含水量差异有统计学意义（P < 0.05）。干预后，研究组血清SOD活性高于对照组，而MDA含量低于对照组（P < 0.05）。 结论 补阳还五汤对大鼠全脑缺血再灌注损伤具有一定治疗作用，其作用与缩短不同时间点L型Ca2+通道平均开放时间、降低大鼠脑组织含水量、增高大鼠血清SOD活性及降低MAD含量有关。

[关键词] 补阳还五汤;大鼠全脑缺血;再灌注;L型Ca2+通道;药效研究

[中图分类号] R285.5          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）06（a）-0013-04

Effects of Buyang Huanwu Decoction on the average opening time of L-type Ca2+ channel in rats with global cerebral ischemia-reperfusion

LIANG Yixian1   ZHOU Guanghui1   LIAO Zhongbo1   ZHAO Qing1   RUI Jun1   ZHANG Jiping2   QIN Manni1

1.Department of Clinical Laboratory， Dongguan Third People′s Hospital， Guangdong Province， Dongguan   523326， China; 2.Department of Rehabilitation Medicine， Foshan Hospital Affiliated to Southern Medical University， Guangdong Province， Foshan   528000， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of Buyang Huanwu Decoction on the average opening time of L-type Ca2+ channel in rats with global cerebral ischemia-reperfusion. Methods Sixty-two rats with global cerebral ischemia-reperfusion were prepared by four-vessel occlusion method. They were divided into control group and research group by random number table method， with 31 rats in each group. The control group was fed with normal saline， while the research group was fed with Buyang Huanwu Decoction. After 2， 12， 24， 48 and 72 h of treatment， the rats were observed. The average opening time of L-type Ca2+ channel， brain water content， serum superoxide dismutase （SOD） and malondialdehyde （MDA） levels were compared between the two groups at different time points. Results The average opening time of L-type Ca2+ channels in the study group was significantly shorter than that in the control group （P < 0.05）. Compared with 72 h after reperfusion， the average opening time of L-type Ca2+ channels in the two groups at different time points were statistically significant （P < 0.05）. After ischemia-reperfusion treatment， the water content in the study group was also significantly lower than that in the control group （P < 0.05）. Compared with 72 h after reperfusion， the brain water content in the other time points of the two groups were significant difference （P < 0.05）. After intervention， serum SOD activity of the study group was higher than that of the control group and the MDA content was lower than that of the control group （P < 0.05）. Conclusion Buyang Huanwu Decoction has a certain therapeutic effect on global cerebral ischemia-reperfusion injury in rats. Its effect is related to shortening the average opening time of L-type Ca2+ channel at different time points， decreasing the brain water content of rat， increasing the activity of serum SOD and decreasing the content of MAD in rat.

[Key words] Buyang Huanwu Decoction; Rat global cerebral ischemia; Reperfusion; L-type Ca2+ channel; Pharmacodynamic study

随着经济社会的发展，脑血管疾病严重危害着人类的健康。在对脑缺血再灌注后，脑组织损伤程度会因迅速的增剧现象加重脑组织细胞的损伤程度，但是恢复脑神经功能的基础就是对脑组织再灌注，故保护脑细胞功能需要消除再灌注损伤。由于颅内的缺血问题以及缺氧问题导致的脑梗死是临床上主要的脑血管疾病之一，会影响患者的神经功能，因其发病率及致残率高而受到医学界的广泛关注，部分脑梗死患者会出现血管以及神经元的损伤，从而出现生活方面的障碍[1]。补阳还五汤是良好的治疗脑缺血药物之一，其具有活血化瘀通络的作用，现在常用于治疗泌尿系统疾病以及心脑血管疾病。传统治疗主要使用抗凝、溶栓、抗血小板聚集以及促进侧支循环等干预措施，虽然能够改善患者症状，但对恢复患者的生活质量效果不够理想。全脑缺氧后想要快速恢复大脑相关功能，为尽可能减少损伤，实施再灌注是一项非常有效的治疗措施，广东省东莞市第三人民医院（以下简称“我院”）在脑缺血患者治疗的同时，联合使用补阳还五汤，取得了明显效果，现采用大鼠制备全脑缺血模型，探讨其作用机制。

1 对象与方法

1.1 实验动物

选取SD大鼠90只，体重280～350 g，1～3月龄，由广州中医药大学实验动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK（粤）2013-0020;SPF级环境由广州中医药大学（大学城）实验动物中心提供，动物使用许可证号：SYXK（粤）2013-0085。

1.2 方法

补阳还五汤原方：黄芪120 g、归尾6 g、赤芍4.5 g，红花、桃仁、川芎、地龙各3 g，本研究用原方中药材的3倍量，并加入8倍水，煎煮2次，≥2 h/次，滤除药渣，所得滤液保留，过夜处理，然后再过滤，制成补阳还五汤含药1 g/mL。

应用四血管闭塞法复制全脑缺血模型，建立大鼠全脑缺血再灌注模型成功的指标包括：①大鼠某些反射消失，包括对光反射、翻正反射等[2];②角膜反射不敏感甚至消失;③仍可出现睫毛反射;④将双侧的颈动脉作夹闭处理，约1 min内大鼠的意识出现障碍[3];⑤大鼠自主呼吸速度增加;⑥毛发竖立;⑦小便不受意识控制[4]。排除标准：在再灌注期间大鼠出现全身痉挛甚至死亡。采用随机数字表法将造模成功的动物分为对照组（n = 31）和观察组（n = 31），对照组采用2 mL/100 g蒸馏水灌服，1次/d;观察组应用补阳还五汤2 mL/100 g灌服，1次/d，两组大鼠均连续用药2周，给药结束2 h后复制模型[5]，在缺血再灌注后2、12、24、48、72 h五个时间点取材，并进行指标检测。

1.3 观察指标

比较两组大鼠不同时间点L型Ca2+通道平均开放时间、脑组织含水量、大鼠血清超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）含量。应用经典干湿重法测定脑组织含水量，计算公式：脑组织含水量（%）=（湿脑重量-干脑重量）/湿脑重量×100%。实验方法及含量测定按试剂盒说明进行蛋白定量，即按lowry法测定脑组织中SOD和MDA含量。

1.4 统计学方法

采用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验;计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组大鼠不同时间点L型Ca2+通道平均开放时间比较

研究组大鼠再灌注2、12、24、48、72 h L型Ca2+通道平均开放时间明显低于对照组（P < 0.05）。与本组再灌注72 h比较，两组其余各时间点L型Ca2+通道平均开放时间差异均有统计学意义（P < 0.05）。见表1。

2.2 两组大鼠再灌注脑组织含水量比较

研究组大鼠再灌注2、12、24、48、72 h脑组织含水量明显低于对照组大鼠（P < 0.05）。与本组再灌注72 h比较，两组其余各时间点脑组织含水量差异均有统计学意义（P < 0.05）。见表2。

2.3 两组大鼠干预前后血清SOD活性、MDA含量比较

两组大鼠干预前血清SOD活性、MDA含量比较，差异无统计学意义（P > 0.05）;干预后，研究组大鼠血清SOD活性明显高于对照组（P < 0.05），但MDA含量明显低于对照组（P < 0.05）。见表3。

3 讨论

脑缺血损伤在临床上具有极高的发病率以及死亡率，主要表现为脑循环血量下降，大多数出现脑缺血损伤的患者都会出现运动行为障碍以及认知功能障碍，对其生活质量影响重大。诱发全脑缺血的因素很多，临床研究中发现Ⅲ型主动脉弓是全脑血管造影致血栓栓塞的临床危险因素，患者弓上动脉与主动脉弓之间夹角小、开口处位置较低，增加了脑缺血发生概率[6];另外，空腹血糖也是重要危险因素之一，血糖存在促进血液凝固及控制纤溶反应等作用，其能让血液出现高凝状态。此外，高血糖加快血红蛋白糖基转变，使组织缺少氧气造成代谢异常，损害血管内皮细胞，血栓形成速度加快[7];临床操作中经常发生因导丝或导管在到达目标血管时，与硬化斑块血管壁碰撞导致斑块堵塞远端血管，也就是说，目标血管内斑块越多，脑缺血率越高。补阳还五汤属于中药方剂，主要功效能够活血通络，对治疗脑缺血的意义十分重大[8]。脑缺血损伤中一般存在两种细胞损伤机制：一种是在缺血早期时段内神经细胞发生水肿以及坏死的情况，另一种是在缺血再灌注2～7 d内迟发性神经元受到损伤，以及神经细胞坏死，脑缺血再灌注以后会产生大量的炎性因子以及细胞凋亡因子，使脑细胞的损伤程度进一步增加。年齡是脑栓塞重要因素之一，患者因年龄增长，左心房扩大，左心室血流速度减慢，临床研究发现栓塞患者均为年龄>75岁的老年患者，其中女性患者占很大一部分，其原因可能是女性患者分泌激素较低或激素分泌紊乱所致[9]。

CD62p以及CD63都会刺激PAF的合成，使炎性反应发生恶性循环，也会使血小管的活性进一步增加阻断新的血管，使神经元由于脑缺血的损害进一步增加，导致脑血管进一步发生病变，导致内皮细胞的损伤。本研究发现，干预后观察组大鼠血清SOD活性高于对照组，但MDA含量低于对照组，全脑缺血后再灌注会使神经细胞出现损伤，自由基所发生的一连串的系列反应使得细胞结构遭到破坏，被破坏的部位主要是生物体中的膜结构，其中的磷脂不饱和脂肪酸发生系列反应，最终得到的是脂质类的过氧化物MDA。缺血再灌注并且经处理后研究组大鼠不同时间点L型Ca2+通道平均开放时间明显短于对照组大鼠（P < 0.05），而生物体中清除自由基的最重要的物质就是SOD，这种物质在大多数的生物体内广泛存在，属于一种金属性质的酶，能够对超氧阴离子自由基实施具有选择性及针对性的清除，使得超氧自由基的特殊作用即氧化作用收到不同程度的压制[10]。本研究发现，干预后研究组大鼠血清SOD活性明显高于对照组，但MDA含量则明显低于对照组（P < 0.05），提示补阳还五汤能使大鼠SOD活性显著增高，而MAD含量降低，从而有助于改善全脑缺血缺氧。

神经细胞中导致缺血性脑损伤的一个不可忽视的因素就是Ca2+的代谢失调。全脑缺血再灌注会导致生物体内Ca2+的代谢受到影响，细胞内外Ca2+的稳定对于生物体来说具有十分重大的意义，因此全脑缺血再灌注后生物体内Ca2+的代谢受到广泛的关注[11]。本研究发现缺血再灌注并且经处理后研究组大鼠不同时间点L型Ca2+通道平均开放时间明显短于对照组，提示补阳还五汤对维持细胞内外Ca2+的代谢稳定具有一定作用[12]。

中医理论将脑缺血归属于“中风”这一范畴，患者往往是因为年老体弱、脏腑功能出现失调而使得瘀血内生，最终出现脑脉痹阻[13-14]。因此，在该病的治疗过程当中，中医强调同治痰瘀。從痰瘀阻络的病因病机出发，使用化痰通络药，主要目的在于通络祛风以及化痰通腑[15]。补阳还五汤，顾名思义，就是指此种汤药能够带给服用之人充足的阳气。现代研究[16]发现，方中黄芪、赤芍、红花、桃仁、川芎、地龙、归尾联用，相辅相成，能够活血化瘀、补气养血，使得自由基对神经细胞的损伤程度大大下降，生物体中的微循环以及某些部位如心肌的缺氧状况得以改善。本研究采用的大鼠全脑缺血再灌注模型与人脑半球缺血性梗死极度的接近，与临床患者的病情高度接近，实验效果良好[17]。一氧化氮散布在中枢神经的各个脑区，其在大脑内具有多种作用，例如调节脑血流、参与突触可塑性、炎症性损害以及神经元兴奋毒性等，在脑缺血初期对细胞具有明显的保护作用[18]。随着缺血再灌注时间的延长，一氧化氮含量会短暂性的增高，加重损害神经细胞，表现出神经毒作用，经实验[19]表明脑缺血时的血浆浓度与脑水肿的程度、梗死灶大小等一致，在发生脑梗死时，其平衡将失控，舒缩血管比例失调是加重脑组织损伤的重要原因。本研究提示补阳还五汤能够降低脑组织内一氧化氮含量，提升脑缺血再灌注大鼠脑内SOD的活性，使自由基对脑组织的伤害减轻，明显减少缺血再灌注后脑梗死的面积以及脑组织含水量，对脑缺血再灌注损伤具有明显的保护作用，其作用机制较为明显[20]。

综上所述，补阳还五汤在大鼠全脑缺血再灌注中的应用效果明显，对全脑缺血再灌注损伤有保护作用，能够有效减小脑梗死的范围，对大鼠的改善作用较为明显，其作用机制与抗脂质过氧化、降低血液黏度、抑制血小板活化以及防止钙超载有很大关系。

[参考文献]

[1]  周娜，赵雅宁，李佳宁，等.跑台运动预处理对全脑缺血再灌注大鼠海马区CyclinA和CyclinE蛋白表达的影响[J].中华行为医学与脑科学杂志，2016，7（2）：112-116.

[2]  于妮娜，陈世忠，张恩户，等.和厚朴酚对全脑缺血再灌注犬血浆TXB2、6-K-PGF1α、ET、NO的影响[J].世界中西医结合杂志，2016，9（8）：1091-1093.

[3]  孙竹梅，赵雅宁，陈长香，等.力竭运动预处理对全脑缺血再灌注大鼠海马区GAP-43与Nogo-A的影响[J].中华行为医学与脑科学杂志，2016，25（8）：682-686.

[4]  Zhu L，Li JY，Zhang YM，et al. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of Shengjiang decoction in rats with acute pancreatitis for protecting against multiple organ injury [J]. World J Gastroenterol，2017，23（46）：8169-8181.

[5]  杨文博，蒋丽丽，刘陕岭，等.红景天苷并亚低温对全脑缺血再灌注损伤后大鼠脑的保护作用[J].青岛大学医学院学报，2016，56（3）：283-286.

[6]  王金鑫，卢国彦，郭虹，等.心脑舒通胶囊对蒙古沙鼠全脑缺血再灌注损伤模型的神经保护作用[J].中国临床药理学杂志，2017，33（6）：518-521.

[7]  郭向飞，赵雅宁，李建民，等.mTOR/自噬通路在间歇性低氧全脑缺血再灌注大鼠海马区的表达及意义[J].中华耳鼻咽喉头颈外科杂志，2016，51（10）：761-767.

[8]  谭永星，袁楠楠，夏裕宁，等.H2对大鼠全脑缺血再灌注损伤后海马CA1区神经元及树突棘的保护作用[J].中华神经医学杂志，2016，15（11）：1091-1097.

[9]  孙竹梅，赵雅宁，李建民，等.不同强度运动预处理对全脑缺血再灌注大鼠生长相关蛋白-43、轴突生长抑制因子Nogo—A表达的影响[J].解剖学杂志，2018，56（1）：40-44.

[10]  范婧婧，惠康丽，徐苗苗，等.低温对大鼠全脑缺血再灌注时脑组织动力相关蛋白1表达的影响[J].中华麻醉学杂志，2016，36（11）：1397-1399.

[11]  Zhang Y，Lin Y，Zhao H，et al. Revealing the Effects of the Herbal Pair of Euphorbia kansui and Glycyrrhiza on Hepatocellular Carcinoma Ascites with Integrating Network Target Analysis and Experimental Validation [J]. Int J Biol Sci，2016，12（5）：594-606.

[12]  仇志富，吴晓光，祖炳学，等.補阳还五汤对脑出血模型大鼠脑组织CXCR4-PI3K自噬信号传导通路及Beclin-1的影响[J].中国组织工程研究，2016，20（27）：3992-3998.

[13]  张娥铿，邓聪.补阳还五汤对慢性肾脏病大鼠的肾保护作用研究[J].现代中西医结合杂志，2017，26（7）：698-700.

[14]  俞天虹，潘华阳.补阳还五汤及其拆方对脑缺血大鼠神经功能及血管生成的影响[J].中国脑血管病杂志，2017， 14（2）：87-93.

[15]  王铁烽，费雅蓉，潘杭，等.补阳还五汤对MCAO模型大鼠血清TXB2、6-keto-PGF1α的影响[J].中国医院药学杂志，2016，36（10）：818-821.

[16]  钟芳芳，吴承龙，孙新芳，等.补阳还五汤联合依达拉奉对脑缺血再灌注小鼠的神经功能与脑梗死体积的影响[J].中华老年心脑血管病杂志，2016，18（12）：1312-1314.

[17]  韦辰，王士雷，孔宪刚，等.补阳还五汤对脑缺血再灌注损伤大鼠线粒体分裂蛋白Drp1、Fis1及细胞色素C表达的影响[J].陕西中医，2017，38（10）：1481-1483.

[18]  史文心，周郦楠.补阳还五汤对短暂性脑缺血再灌注大鼠海马神经元细胞及5-HT影响[J].辽宁中医药大学学报，2016（5）：62-64.

[19]  赖日明，朱原，郑丽娴，等.补阳还五汤对脑缺血再灌注损伤大鼠GSK3β mRNA的影响[J].广州中医药大学学报，2016，33（3）：362-366.

[20]  钟芳芳，吴承龙，孙新芳，等.补阳还五汤联合依达拉奉对脑缺血再灌注损伤小鼠神经细胞线粒体凋亡途径的影响[J].中华全科医学，2016，14（11）：1844-1847.