HPLC法测定蒿秦化斑颗粒中四种成分的含量

王夏　龚韬　孙丽蕴　李拓新　朱青　宋京美

[摘要] 目的 建立蒿秦化斑顆粒中马钱苷酸、龙胆苦苷、芍药苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷含量的高效液相色谱（HPLC）测定方法。 方法 采用Kinetex EVO C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-0.1%磷酸为流动相，梯度洗脱，流速1.0 mL/min，检测波长235 nm，柱温35℃。 结果 马钱苷酸、龙胆苦苷、芍药苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的标准曲线分别为Y=1.5×103X-0.88（r = 0.9999）、Y=9.8×102X-2.95（r = 0.9999）、Y=1.4×103X-3.97（r = 0.9999）、Y=2.4×103X-0.33（r = 0.9999）;线性范围分别为0.03～0.69 mg/L、0.15～3.00 mg/L、0.17～3.44 mg/L、0.01～0.11 mg/L，平均加样回收率分别为97.85%、98.30%、94.66%、96.08%，RSD分别为1.00%、0.69%、1.72%、1.90%。 结论 该方法简便、准确、重复性好、专属性强，可用于蒿秦化斑颗粒中四种成分的含量测定。

[关键词] 蒿秦化斑颗粒;马钱苷酸;龙胆苦苷;芍药苷;5-O-甲基维斯阿米醇苷;高效液相色谱法;含量测定

[中图分类号] R286.0          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）06（a）-0028-05

Content determination of four components in Haoqin Huaban Granules by HPLC

WANG Xia1   GONG Tao1▲   SUN Liyun2   LI Tuoxin1   ZHU Qing1   SONG Jingmei1

1.Institute of Clinical Pharmacy of Beijing Municipal Health Bureau， Beijing   100035， China; 2.Dermatology， Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine Affilionted to Capital Medical University， Beijing   100010， China

[Abstract] Objective To establish high-performance liquid chromatography （HPLC） method for the content determination of the loganic acid， gentiopicroside， paeoniflorin and 5-O-methylvisamminol in Haoqin Huaban Granules. Methods The column was Kinetex EVO C18 （150 mm × 4.6 mm， 5 μm）. The mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution with gradient elution at the flow rate of 1.0 mL/min. The detecting wavelength was 235 nm and the column temperature was 35℃. Results The standard curve of loganic acid， gentiopicroside， paeoniflorin and 5-O-methylvisamminol were Y = 1.5×103X - 0.88 （r = 0.9999），Y = 9.8×102X - 2.95 （r = 0.9999），Y =1.4×103X - 3.97 （r = 0.9999），Y =2.4×103X - 0.33 （r = 0.9999）， and the linear ranges of loganic acid， gentiopicroside， paeoniflorin and 5-O-methylvisamminol were 0.03-0.69 mg/L， 0.15-3.00 mg/L， 0.17-3.44 mg/L， 0.01-0.11 mg/L，respectively. The average recoveries of loganic acid， gentiopicroside paeoniflorin and 5-O-methylvisamminol were 97.85%， 98.30%， 94.66%， 96.08%， the RSD were 1.00%，0.69%，1.72%，1.90%， respectively. Conclusion The method is simple， accurate and reproducible. It is effective in controlling the quality of Haoqin Huaban Granules.

[Key words] Haoqin Huaban Granules; Loganic acid; Gentiopicroside; Paeoniflorin; 5-O-methylvisamminol; High-performance liquid chromatography; Content determination

中药最重要的特点就是多成分、多靶点，中药的多种活性成分是其发挥疗效的物质基础，多成分的质控模式是中药质量控制研究的重点[1-2]。蒿秦化斑颗粒由青蒿、地黄、水牛角、秦艽、赤芍、牡丹皮、防风、甘草8味药材组方而成，具有清热解毒、凉血化癍的功效，用于日晒疮，热毒蕴肤证。本研究在原质量标准的基础上，优化改进测定方法[3-17]，采用高效液相色谱法测定马钱苷酸、龙胆苦苷、芍药苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷4种成分的含量，方法准确、操作简便，提供了更加全面有效的定量分析手段。

1 仪器与试药

1.1 仪器

高效液相色谱仪（美国Agilent，1100）;DAD二极管阵列检测器（美国Agilent）;电子天平（METTLER TOLEDO，XP105DR）;紫外-可见光光度计（SHIMADZU，UV2600）;超声波清洗器（北京科玺世纪科技有限公司，KX-2127QT）。

1.2 试药

马钱苷酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111865-201403，纯度：94.7%）;龙胆苦苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110770-201716，纯度：97.6%）;芍药苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110736-200630，纯度100%）;5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：1523-200001，纯度：93.8%）。

蒿秦化斑颗粒（每1 g含生药3.113 g，规格：12 g/袋，批号：170424，170425，170426），属于首都医科大学北京中医医院院内制剂。乙腈（Fisher Chemical，色谱纯）、磷酸为优级纯，水为超纯水，其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Kinetex EVO C18色谱柱（150 mm × 4.6 mm，5 μm），以乙腈-0.1%磷酸为流动相，梯度洗脱，流速1.0 mL/min，检测波长235 nm，柱温35℃，进样量为10 μL。

2.2 混合对照品溶液制备

精密称取马钱苷酸、龙胆苦苷、芍药苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品适量，加50%甲醇制成每1 mL含马钱苷酸34.76 μg、含龙胆苦150.30 μg、含芍药苷172.16 μg、含5-O-甲基维斯阿米醇苷5.50 μg混合对照品溶液，即得。

2.3 供试品溶液制备

取蒿秦化斑颗粒，研细，精密称定0.3 g，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，称定重量，超声处理（功率180 W，频率60 kHz）30 min，取出，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 阴性对照溶液制备

按处方中药味的比例及制法分别制备不含秦艽（马钱苷酸、龙胆苦苷）、防风（5-O-甲基维斯阿米醇苷）、赤芍和牡丹皮（芍药苷）的阴性样品，再按照“2.3”项下方法制备相应的阴性对照溶液。

2.5 专属性考察

分别精密吸取供试品溶液、对照品溶液、阴性对照溶液各10 μL注入液相色谱仪，结果表明阴性对照不干扰对应成分的测定且其分离度均大于1.5，表明此方法的专属性较强。见图1。

2.6 线性关系考察

分别精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液1、2、5、10、15、20 μL，按照“2.1”项下色谱条件进样测定，以进样量为横坐标，以峰面积值为纵坐标，分别绘制标准曲线，计算回归方程及线性范围。见表2。

2.7 精密度試验

精密吸取同一标准品溶液5 μL，按“2.1”项下色谱条件测定，连续进样6次，分别记录马钱苷酸、龙胆苦苷、芍药苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷四种成分的峰面积，其RSD分别为0.80%、0.36%、0.53%、1.32%，提示仪器精密度良好。

2.8 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别在0、4、8、12、16 h按“2.1”项下色谱条件测定，计算马钱苷酸、龙胆苦苷、芍药苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷峰面积的RSD分别为0.52%、0.88%、0.86%、1.92%，提示供试品溶液在16 h内基本稳定。

2.9 重复性试验

取同一批样品6份，精密称定，按“2.3”项下方法制备，按“2.1”项下色谱条件测定，结果马钱苷酸平均含量为0.1697%，RSD为0.18%;龙胆苦苷平均含量为0.6995%，RSD为0.70%;芍药苷平均含量为0.7582%，RSD为0.49%、5-O-甲基维斯阿米醇苷平均含量为0.0226%，RSD为1.96%，提示该方法重复性良好。

2.10 加样回收率试验

取已知含量的蒿秦化斑颗粒样品9份，每份0.15 g，精密称定，分别按已知含量的50%、100%、150% 3个水平加入对照品，按“2.3”项下方法制备，按“2.1”项下色谱条件下测定，计算加样回收率。马钱苷酸、龙胆苦苷、芍药苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的平均加样回收率分别为97.85%、98.30%、94.66%、96.08%，RSD分别为1.00%、0.69%、1.72%、1.90%，提示该方法的准确性良好。见表3。

2.11 含量测定

取3批蒿秦化斑颗粒样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件下测定马钱苷酸、龙胆苦苷、芍药苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的含量。见表4。

2.12 高效液相色谱法的耐用性考察

在耐用性考察范围内，色谱条件中检测波长、流动相酸度、流速微小变化时，含量测定结果差异无统计学意义（P > 0.05），而柱温改变对含量测定结果影响较大，应在实验中予以关注并严格控制。见表5。

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（收稿日期：2018-12-03  本文编辑：王   蕾）