甲状腺组织冷冻切片的优化

丁丽红，方庆全，张翠霞

（厦门大学附属第一医院病理科，厦门 361003）

冷冻切片是利用低温条件快速将组织冷冻成具有一定硬度以切出薄片的过程[1]，近年来该技术已经逐渐应用到术中病理诊断中[2-5]。术中冷冻切片病理诊断可以确定病变、了解恶性肿瘤的扩散情况、确定肿瘤部位的手术切缘是否有肿瘤组织残留，因此，深受术中外科医师的青睐。由于甲状腺组织细胞丰富、血供丰富、常伴有囊肿[6]，其冷冻制片技术受多种因素的影响，如取材厚度、速冻方法、染色方法等，制作冰冻切片过程易出现裂隙、冰晶形成、胶质脱落等现象，制片难度较大，易导致术中病理诊断困难[7]。为此，作者通过对比实验，从甲状腺组织冷冻切片的几个关键环节入手，研究优化方案，以期提高其制片质量。

资料与方法

1 资料

收集我院病理科2018年1月至2018年12月接收的新鲜甲状腺标本，患者年龄22～70岁，平均年龄(38.7±10.6)岁。

2 主要设备

LEICA CM1950冷冻切片机（德国莱卡）；达科为自动染色机（达科为医疗设备有限公司）。

3 试剂

冷冻切片专用包埋剂，AAF液(由乙酸、95%乙醇、甲醛按5：85：10的比例配制而成)， 新鲜配制的Harri苏木素染液，1%盐酸乙醇，0.5%酸化伊红，75%、85%、95%、无水梯度乙醇，二甲苯。

4 制作“冰垫”托头

制作方法同王玉环等介绍的方法[8]。取冷冻切片机配套托头，加上约0.2 cm 厚的包埋剂后，置于冷冻切片机冻台上进行速冻，包埋剂冻上后，用冷冻切片机将托头上的包埋剂修平并修至余下约0.1cm厚，形成带包埋剂垫的“冰垫”托头，置于预先设置至-25℃的冻台上备用。

5 冷冻切片制备

不同取材厚度条件下甲状腺组织冷冻切片的制备：收集已行术中冷冻切片病理诊断后剩余的新鲜甲状腺标本40例，每例切取质地相近、面积约为1.5cm×1cm的4块组织，按取材厚度0.2cm、0.3cm、0.4cm、0.5cm分别编为A、B、C、D组，取出“冰垫”托头，于室温（＞20℃）回暖 3～4s 后，将甲状腺组织放于“冰垫”托头中部，加适量冷冻切片专用包埋剂，移至-25℃的冷冻切片机冻台上速冻并于上方加盖冷冻冰锤，甲状腺组织冻成冻块后，移至-17℃～-10℃的平台上回暖30s，用夹头设置为-17℃的冷冻切片机修至所需切面（尽量少修）后，切取所需切片（厚度为 6μm），立即放入固定液固定30s，取出切片置于达科为自动染色机内染色，中性树胶封固、显微镜观察。甲状腺组织冷冻切片制备流程如图1。比较不同取材厚度对甲状腺组织冷冻切片制片质量的影响。

图1 甲状腺组织冷冻切片制备流程图Fig. 1 Flow chart of preparation method of thyroid tissue frozen sections

不同速冻方法下甲状腺组织冷冻切片的制备：取已行术中冷冻切片病理诊断后剩余的新鲜甲状腺标本40例，每例切取质地相近、大小为 1.5cm×1cm×0.3cm 的甲状腺组织5块，随机取其中1块组织，按前述B组的方法进行冷冻切片制备（E组）；再随机取另1块组织，立即置于-25℃、未置于室温回暖的“冰垫”托头上速冻，余操作同B组（F组）；再随机取1块组织，将托头连同组织放置于预先冷冻至-18℃的冻台上进行速冻，余操作同B组（G组）；再随机另取1块组织，立即置于-25℃、未预先制作“冰垫”的托头上速冻，余操作同B组（H组）；剩余的1块组织，放置于无“冰垫”的常温托头上，加适量冷冻切片机专用包埋剂后，置于-25℃的冻台上进行速冻，余操作同B组（I组）。比较5种不同速冻方法下甲状腺组织冷冻切片制备过程中组织块崩裂的发生率、速冻完成时间，及裂隙、冰晶及组织结构清晰度 3项指标的得分情况。

不同染色方法下甲状腺冷冻切片的制备：收集已行术中冷冻切片病理诊断后剩余的新鲜甲状腺标本100例，按前述B组的方法取材、速冻、切片（连续切片2片）、固定，随机取其中1片，按中华医学会编著的《临床技术操作规范病理学分册》的操作步骤进行染色（J组）；另1片采用达科为自动染色机（每缸染色液的染色时间同J组）进行染色（K组）。比较 2种不同染色方法下甲状腺冷冻切片的染色优良率、染色效率等指标。

6 冷冻切片质量观察指标

切片有无裂隙、冰晶、组织结构清晰3项评分各10分，评分标准如下：若切片无裂隙、无冰晶、组织结构清晰，则各得分为10分；若切片见少量裂隙、冰晶，组织结构较不清晰，尚不影响观察，减1～2分；若切片见多量裂隙、冰晶，组织结构不清晰，一定程度的影响观察，减3～6分；若切片见大量裂隙、冰晶，组织结构模糊不清，严重影响观察，减7～10分。得分结果采用¯x±s表示。由2名质控师对所有冷冻切片进行双盲评片，每项指标的得分为评分的均值。每项指标的得分≥9分为优，7.5～8.9分为良，6.0～7.4为基本合格，≤5.9分为不合格。

7 统计学分析

应用SPSS17.0 进行统计学分析，计数资料率的比较采用χ2检验，计量资料用¯x±s表示，用配对t检验两两比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 取材厚度对甲状腺组织冷冻切片制片质量的影响

不同取材厚度条件下甲状腺组织冷冻切片观察有无裂隙与冰晶2项指标评分结果。A、B 两组无裂隙与无冰晶2项指标得分差异均无统计学意义（P均＞0.05）；B组无裂隙、无冰晶2项指标得分高于C组与D组，差异均有统计学意义（0.01＜P＜0.05）（表1）。可见，甲状腺组织冷冻切片取材厚度以0.2～0.3cm 为佳（图2）。

表1 甲状腺冷冻切片不同取材厚度条件下无裂隙、无冰晶指标得分Tab.1 No crack and no ice crystal index score of thyroid tissue frozen section with different thickness

图2 取材厚度对甲状腺组织冷冻切片的影响。a，B组，取材厚度0.3cm裂隙少、冰晶少；b，C组，取材厚度0.4cm裂隙较多、冰晶较多；c，D组，取材厚度0.5cm裂隙多、冰晶多；比例尺，100μmFig. 2 The effect of the thickness of material on the preparation for thyroid frozen section. a, group B, section with the thickness of 0.3cm had less cracks and ice crystals； b, group C, section with the thickness of 0.4cm had cracks and ice crystals； c, group D, section with the thickness of 0.5cm had more cracks and ice crystals； scale bar,100μm

2 速冻方法对甲状腺组织冷冻切片质量的影响

观察不同速冻方法条件下甲状腺组织冷冻切片无冰晶、无裂隙及组织结构清晰情况。E、G、I 组未出现冷冻组织块崩裂现象，F 组 15.0%（6/40）、H 组17.5%（7/40）出现冷冻组织块崩裂现象，F、H 2组组织块崩裂发生率均高于 E 组，差异均有统计学意义（χ2=4.50、5.64，0.01＜P＜0.05）。E、F、G、H、I 组平均速冻时间分别为 83.2±9.3s、82.5±9.6s、107.4±10.1s、86.7±7.8s、168.9±12.5s，E 组平均速冻时间显著少于 G、I 组（P均＜0.01）；E、F、H 3组平均速冻时间两两比较，差异均无统计学意义（P均＞0.05）。E、F、H 3组无冰晶、无裂隙及组织结构清晰3项指标的得分组间两两比较，差异均无统计学意义（P均＞0.05）；E组无冰晶、无裂隙及组织结构清晰指标3项的得分均高于G组与I 组，差异均有统计学意义（0.01＜P＜0.05）（表2）。可见E组的速冻方法最佳（图3）。

3 染色方法对甲状腺组织冷冻切片质量的影响

J组的染色优良率为94%（188/200），低于 K组的98%（196/200），差异有统计学意义（χ2=4.17，0.01＜P＜0.05）。单台冷冻切片染色时，J组染色时间为301.1±2.083s，K组为297.2±0.186s，两组比较，差异无统计学意义（t=1.865，P＞0.05）。当2份标本同时送检或2份标本送检时间相距＜2min，其切片需同时染色时，J组染色时间为556.9±1.714s，长于K组的495.1±0.1475s，差异有统计学意义（t=35.92，P＜0.001）。可见，机染的甲状腺组织冷冻切片质量更佳。

讨 论

1905年 Wilson Mecarty 将冷冻切片技术列为病理诊断方法之一［9］。冷冻切片可对术中病变组织做出精准的诊断，可为外科医师下一步的手术方案的制定提供依据，预防手术切除不足或过度切除[10]。

表2 甲状腺不同速冻方法条件下冷冻切片3项指标得分Tab.2 Three index scores of thyroid tissue frozen sections prepared by different quick freezing method

图3 速冻方法对甲状腺冷冻切片的影响。a，E组，预先制作“冰垫”托头与甲状腺组织置于-25℃的冷冻台速冻并于上方加盖冷冻冰锤，冰晶少、裂隙少、组织结构清晰；b，G组，冻台预先设置至－18℃，冰晶较多、裂隙较多、组织结构较不清晰；c，I组，托头常温无“冰垫”，冰晶多、裂隙多、组织结构较不清晰；比例尺，100μmFig. 3 The effect of quick freezing methods on thyroid tissue frozen section. a, group E, quick freezing by putting thyroid tissue with a pre-made “ice blanket” support at -25℃ cryostage, covered with a frozen ice hammer reduced ice crystals and fractures, improved clarity of tissue structure； b, group G, preset cryostage at -18℃ showed increased ice crystals and fractures, decreased clarity of tissue structure； c, group I, “blanket” at room temperature without ice showed more ice crystals and fractures, less clarity of tissue structure； scale bar,100μm

甲状腺癌是目前临床较为常见的一种甲状腺恶性肿瘤，甲状腺癌尤其是甲状腺微小癌发生率呈逐年上升趋势［11,12］，成为我国术中冷冻切片诊断中的主要疾病之一[13]。但甲状腺组织细胞学表现差异大，易发生误诊漏诊，给病理医师带来很大的挑战。冰冻切片质量的好坏直接影响病理诊断准确性。为减少误诊漏诊率，提高病理诊断准确性，优化冰冻切片制作条件、保障冰冻切片质量对临床工作尤为重要。

甲状腺组织冷冻切片的取材技术对其诊断具有至关重要的影响，尤其是含有甲状腺微小乳头状癌的取材，如果肿瘤过小、或者取材医师经验不足、或者取材困难时，容易发生漏诊[14]。许多学者研究发现，在不影响诊断的前提下，冷冻切片取材应尽量小一些，一般可切取1.5cm × 1.5cm × 0.3cm 大小，组织厚度勿超过4mm[15]。作者发现，甲状腺新鲜组织行冷冻切片制备时，其取材厚度控制在0.2～0.3cm时，冷冻切片染色后观察时出现裂隙或冰晶的现象很少，而当取材厚度≥0.4cm时，由于在相同低温条件下组织冻成冻块的时间显著延长，其冷冻切片染色片出现裂隙与/或冰晶的现象显著增加，说明取材厚度以0.2～0.3cm为宜，增加取材厚度反而降低切片质量。

在冷冻切片的制片过程中，应尽量加快组织冷冻速度，使有害的冰晶缩小甚至无明显影响[16,17]。可见，速冻是冷冻切片制备过程中至关重要的步骤之一[18，19]，速冻的目的是在较短时间内应用低温条件快速将组织冷冻成硬块，以便于后续的切片制备工作。F 组的“冰垫”托头未于室温中回暖即将组织块放置于“冰垫”上，组织与“冰垫”粘附不牢固，容易崩裂；H组组织块置于-25℃、未预先制作“冰垫”的托头上进行速冻，组织与托头上的“冰垫”粘附不牢固，后续切片时组织块崩裂发生率达17.5%；G组用-18℃的冻台进行速冻，I组组织放置于常温无“冰垫”托头上，再放入冷冻切片机冻台上进行速冻，这两组平均速冻速度均较E组慢，结果产生的冰晶与裂隙较多，组织结构也较为不清晰，提示速冻时间延长会产生过多有害的冰晶，降低切片质量。

冷冻切片传统手工染色易受染液浓度、试剂温度、染色时间长短、环境温度、不同操作者的习惯等因素影响[20]，使细胞核与细胞质染色强度不稳定，核质对比不鲜明；而自动染色机可以设置统一的染色时间和程序，在做好质控的前提下，可使每一批次的染色步骤与时间都能保持一致，染色后切片透明度好，红蓝分明，细胞核与细胞质对比清晰，而且省时省力[19]。在医院病理科工作中，如果由一名技术员来承担冷冻切片的制备工作，当同时有多份标本需要进行冷冻切片时，一名技术员很难在规定时间内完成所有的冷冻切片制备工作，这时如果需要另一名技术员协助完成工作，就会显著增加人力成本。如果使用自动染色机进行冷冻切片染色后，技术员可以统筹安排，前一例冷冻切片在染色机内进行染色时，可以进行下一例冷冻切片的制备，然后再将切完、固定好的冰冻切片上机进行染色。这样安排，一名技术员可以统筹处理同一时间段送检的多份冷冻切片标本，有效地控制完成冷冻切片的时间，这对及时完成多台冷冻切片的制备，及时发送术中快速病理诊断报告、缩短临床医师手术等候时间、增加疾病控制率以及减少二次手术的风险有着重要的意义。

在甲状腺组织冷冻切片制备过程中，除了上述3项重要条件会对制片效率、切片质量与染色效果造成不同程度的影响外，冷冻切片固定的及时性、固定液的选择、固定时间的长短、切片方法等因素可能也会对制片质量造成一定的影响，值得进一步的研究。

本研究结果表明，甲状腺组织冷冻切片取材厚度以0.2～0.3 cm为佳；预先在冷冻切片托头上制作厚约 0.1～0.2 cm的包埋剂冻成的“冰垫”，速冻甲状腺组织前，取出“冰垫”托头，于室温中回暖 3～4 s 后，将甲状腺组织置于带“冰垫”托头中部，加适量冷冻切片机专用包埋剂，移至-25℃的冷冻台进行速冻并于上方加盖冷冻冰锤为一种较佳的速冻方法；应用自动染色机进行冷冻切片染色，其染色质量优良率、染色效率等指标均优于传统手工染色方法。采取以上优化条件，可显著提高甲状腺组织冷冻切片的制片效率、切片质量与染色效果，为术中病理诊断及手术方案的制定提供保障。