利用慢病毒载体建立fractalkine基因敲低的HK-2稳定细胞株

尤燕舞，付冬冬，王俊杰，Soulixay Senouthai

（右江民族医学院附属医院肾内科，百色 533000）

趋化因子fractalkine（FKN）又称CX3CL1，在1997年首次被Bazan等[1]人发现，是CX3C家族中的唯一成员。FKN是7次跨膜大分子糖蛋白，由373个氨基酸组成。在人类基因组中位于16号染色体q13片段处，在啮齿类动物基因组中，位于8号染色体中心区域[2]。FKN功能上分为4个结构域：细胞外N-末端趋化因子区域（残基1-76）、细胞膜粘蛋白样茎状结构区域（残基77-317）、跨膜α螺旋区域（残基318-336）和短细胞质尾区域（残基337-373）[3]。FKN以膜结合型（95-100kDa）和可溶型（60-80kDa）2种形式存在。膜结合型具有跨膜结构域和位于粘蛋白样茎顶部的趋化因子结构域，可作为黏附分子与表达CX3CR1的免疫细胞相互作用，如CD4+和CD8+T淋巴细胞、单核细胞、自然杀伤细胞[4]。FKN在茎的基底部被肿瘤坏死因子（TNF）α-转换酶即解离素、金属蛋白酶-10和金属蛋白酶-17裂解[5]，产生可溶型趋化因子。可溶型FKN+对CX3CR1+白细胞（树突状细胞、单核细胞、自然杀伤细胞、T细胞等）起化学诱导作用[6]，这两种存在形式致使FKN同时具有黏附和趋化功能[7]。多数趋化因子的配体可亲和多种受体，而FKN只与受体CX3CR1相互作用。FKN广泛分布于肾脏细胞、神经元细胞、肺上皮细胞、肠道细胞中[8-10]。CX3CR1主要表达在单核细胞、自然杀伤细胞、T细胞中，FKN与其结合后，加速细胞的迁移、黏附和增殖。FKN水平升高与多种肾脏疾病的发病机制密切有关，对其作用机制的研究多集中在糖尿病肾病、狼疮性肾炎、肾脏纤维化、肾衰竭、高血压肾小球动脉硬化、原发和继发性肾小球肾炎等。

近年来研究表明，当肾脏内环境稳态失调时，肾小管上皮细胞（HK-2细胞）通过释放炎症因子、趋化因子、募集炎症细胞等，快速启动炎症和免疫反应，同时HK-2细胞可发生转分化以适应机体内环境骤变，参与炎症和免疫的调控作用[11]，HK-2细胞不仅是肾脏固有细胞，受损活化后可作为抗原提呈细胞激活T淋巴细胞，具备免疫细胞的部分功能[12,13]。本课题组前期研究结果发现，用脂多糖刺激HK-2细胞后，FKN表达水平增加[14]。Liu等[15]用糖基化终产物干预HK-2细胞后发现FKN mRNA和蛋白表达显著增加。此外，血清白蛋白刺激HK-2细胞后可通过激活p38MAPK信号通路促进FKN表达水平增加[16]。这些研究结果表明，FKN可能参与HK-2细胞损伤机制。目前尚无文献报道FKN敲低后在HK-2细胞中具体作用。

本研究通过构建携带FKN基因的慢病毒载体，感染并建立FKN基因敲低的HK-2细胞株，旨在为进一步探讨FKN基因在肾脏疾病发病过程中的作用及机制奠定前期实验基础。

材料与方法

1 主要试剂

慢病毒载体及包装系统（包含载体质粒GV248、病毒包装辅助质粒Helper1.0、Helper2.0，质粒结构见图1）、限制性内切酶AgeI/EcoRI酶和连接酶购自上海吉凯基因化学技术有限公司。琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒抽提试剂盒、DNA ladder Marker均购自碧云天生物技术有限公司；DMEM/F12培养基、胎牛血清、ENi.S转染培养基购自Gibico公司。Trizol购自 Invitrogen 公司；cDNA 逆转录试剂盒、Real-time PCR 试剂盒购自天根生化技术有限公司；病毒滴度检测 HIV-1p24 Antigen ELISA 2.0 试剂盒购自北京达科为生物科技有限公司。

2 实验细胞

慢病毒包装实验中用到的大肠埃希菌菌株DH5α、293T细胞由上海吉凯基因化学技术有限公司提供；肾脏HK-2细胞购自中国科学院上海细胞库。

3 FKN基因低表达载体克隆的制备

用AgeI/EcoRI酶对载体质粒GV248（hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin）进行双酶切，将上海吉凯基因化学技术有限公司设计合成的目的基因序列FKN(52621-1)(表1)连接到载体上，获取连接产物，经扩增、纯化后转化感受态大肠埃希菌DH5α，涂布于LB平板抗性培养，挑取单克隆菌落进行PCR鉴定[鉴定引物FKN（52621-1）] ，将鉴定正确的质粒交付上海吉凯基因化学技术有限公司完成测序。将测序正确的菌液转移接种植到10ml含相应抗生素的LB培养基中，在37℃下培养过夜，采用无内毒素质粒小提取试剂盒进行抽提，选择抽提合格的质粒进入后续流程。

图1 质粒结构图谱。a，载体质粒GV248；b，病毒包装辅助质粒Helper1.0；c，病毒包装辅助质粒Helper2.0Fig. 1 Structure maps for the plasmids. a, vector plasmid GV248； b, virus packaging helper plasmid Helper1.0； c, virus packaging helper plasmid Helper2.0

表1 目的基因引物序列信息表Tab. 1 The primer sequences for target genes

4 包装构建携带FKN目的基因的慢病毒（LVFKN-RNAi）

采用上海吉凯基因化学技术有限公司内部研发的失活型慢病毒包装系统。遵照试剂盒操作说明完成实验流程。病毒包装过程中共涉及3种质粒；携带目的基因的工具载体质粒GV248及病毒包装辅助质粒Helper1.0、Helper2.0。采用上述3中质粒转染293T细胞株，大肠埃希菌株DH5α用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒，在完成转然后48～72h获取含有未纯化病毒的细胞上清液，然后经过相应的浓缩纯化处理，制备实验所需的高滴度的慢病毒保存液。

5 LV-FKN-RNAi质量检测

采用HIV-p24 Antigen ELISA2.0试剂盒测定病毒滴度，遵照试剂盒说明操作，用酶标仪测定A450波段吸光度值，测绘标准曲线，并根据106、107倍稀释样品的OD450值计算慢病毒原液滴度。

6 慢病毒感染并筛选HK-2/LV-FKN-RNAi细胞株

通过感染预实验确定慢病毒载体对HK-2细胞株的最佳感染条件（细胞数量、感染试剂、感染后换液时间等）和感染复数（MOI）。实验分组及具体操作步骤如下：①合适感染条件确定：为了确认合适的感染条件，按照不同培养条件将实验分为5组：常规培养基组（A组），观察常规培养条件下病毒对细胞的感染效果；常规培养基+Polybrene组（B组），观察Polybrene是否可以提升感染效果；ENi.S.组（C组），观察用ENi.S.替代常规培养基时病毒对细胞的感染效果；ENi.S.+Polybrene组（D组），观察Polybrene和ENi.S.条件下病毒对细胞感染效果；常规培养基+阴性对照病毒（E组）；Control组，监控实验过程中细胞生长是否正常（表2）。②感染：接种细胞，用完全培养基制备2ml密度 3～5×104个 /ml的细胞悬液，取 100μl/孔加入 96孔板中，共15孔，其中3孔作为Control组，继续培养；第2d用ENi.s将慢病毒依次稀释成1×108TU/ml（MOI=100）、1×107TU/ml（MOI=10）、1×106TU/ml(MOI=1)，各50μl；继而用ENi.S将Polybrene稀释成 50μg/ml，共 200μl，标记为 P(E)；用常规培养基将 Polybrene 稀释成 50μg/ml，共 200μl，标记为P(M)；吸掉上清液，并按照表2向各孔中加入相应体积的溶液，混匀，继续培养；感染后12h换回常规培养基，过程中观察细胞形态。③感染效果检测：第5d（感染约72h后）荧光表达丰度较高时，用显微镜观察感染效果。感染效率80%左右，且细胞生长良好的组所对应的感染条件和MOI即可以作为后续感染实验的依据。④筛选：在6孔板中采用LV-FKN-RNAi感染HK-2细胞，按照感染预实验的最佳感染条件及MOI，在完成感染72h后加入终浓度8μg/ml的Puromycin对细胞进行筛选，3d后减少Puromycin的浓度至0.5μg/ml并维持此浓度培养1周，获得HK-2/LV-FKN-RNAi细胞株，通过Western blot验证结果。

表2 感染实验分组和感染条件Tab.2 Group of experiments and the corresponding experimental conditions

7 Western Blot

分别收集6孔板中Control组、阴性对照组、LVFKN-RNAi感染后的HK-2细胞，每孔加入150μl的RIPA裂解液提取细胞总蛋白，蛋白溶液与上样缓冲液混合后进行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，封闭，用FKN（1: 500）、GAPDH（1: 2000）一抗4℃孵育过夜，二抗孵育1h后进行化学发光，凝胶成像仪拍照取图，分析条带灰度值，以目的条带与内参GAPDH条带光密度的比值表示目标蛋白的相对表达量。

8 CCK-8检测细胞活力

将细胞分为2组：FKN基因敲低组和阴性病毒对照组，接种在96孔板中，培养细胞0h、12h、24h、48h、72h，每组设5个复孔。到达孵育时间后，每孔中加入 10μl的 CCK-8反应液，37℃、5% CO2培养箱孵育1～2h后用酶标仪测定450 nm处各组的吸光度。

9 流式细胞术检测细胞凋亡

收集2组细胞：FKN基因敲低组和阴性病毒对照组，细胞密度为1×106个/ml，1000r/分钟离心5min，弃上清，加入5μl Annexin V-FITC和195μl缓冲液，避光孵育10min，加入5μl的PI液，避光孵育15min，加入400μl缓冲液后上机检测。

结 果

1 慢病毒滴度

按照HIV-p24 Antigen ELISA2.0试剂盒提供的操作流程，计算出标准曲线方程Y=0.6489X-0.0383，R²=0.9906，X为待测样品浓度（pg/ml），Y对应的OD450值。将10-6、10-7病毒原液稀释品测得的OD450值分别带入方程计算对应的病毒原液滴度，并取其平均值为8×107pg/ml（表3），根据试剂盒提供的病毒滴度换算关系10TU/ml=1pg/ml，最终得出制备LV-FKN-RNAi（52621-1）病毒滴度为 8×108TU/ml；阴性对照病毒滴度为1×109TU/ml。

表3 病毒滴度检测Tab. 3 Virus concentration test

2 最佳感染条件及MOI

选择最佳感染条件和相应MOI的原则如下：①在细胞形态不受影响的情况下尽可能用少的病毒感染量；②选择感染效率80%左右的作为最佳感染条件。HK-2细胞达到80%感染效率的最佳感染条件为在ENi.S.+Polybrene培养基中进行感染，MOI为10（图2）。

图2 慢病毒载体在不同实验条件下的感染效果。比例尺，50μmFig.2 The infectious efficiency of HK-2 cells under different experimental conditions for each group. Scale bar, 50μm

图3 慢病毒感染HK-2细胞后绿色荧光表达情况。比例尺，50μmFig.3 Expression of green fluorescent protein in transfected HK-2 cells. Scale bar, 50μm

图4 LV-FKN-RNAi感染对HK-2细胞FKN水平的影响。A，代表性Western blot；B，统计学分析；*与对照组相比， P＜0.01；n=3Fig.4 Effect of LV-FKN-RNAi infection on the level of FKN in HK-2 cells. A, representative Western blot； B, statistical analysis； *P＜0.01, compared with control and negative groups； n=3

3 LV-FKN-RNAi感染有效降低HK-2细胞FKN水平

按照预实验确定的最佳感染条件，在ENi.S.+Polybrene培养基中进行感染（图3），72h后收集细胞，提取蛋白进行Western blot检测FKN水平。结果显示，与空白对照组和阴性病毒对照组相比，FKN基因敲低组细胞中FKN水平显著下调（图4）。

4 沉默FKN促进HK-2细胞纤维化

用LV-FKN-RNAi感染HK-2细胞12h后，更换含10%胎牛血清DMEMF/12完全培养基，继续培养72h，倒置显微镜下观察细胞形态。结果显示，对照组HK-2细胞呈椭圆形，鹅卵石样形态，细胞间隙紧密连接，细胞质丰满，细胞轮廓清晰，边缘光滑，基本无伪足出现（图5A）。感染LV-FKN-RNAi的HK-2细胞大多呈梭形，细胞呈长条状，轮廓清晰，细胞间隙大，细胞体边缘伸出多个伪足，表明抑制FKN低表达可以促进HK-2细胞纤维化的程度（图5B）。

5 LV-FKN-RNAi感染降低HK-2细胞活力

将细胞感染LV-FKN-RNAi和阴性对照病毒后培养0h、12h、24h、48h和72h，采用CCK-8法检测细胞活力。结果显示，两组细胞在12h、24h、48h、72h的活力均比相应0h增强；同一组内，除72h与48h比较无显著差异外，后一时间点的细胞活力均比前一时间点增强；感染LV-FKN-RNAi的细胞在各时间点的活力与感染阴性对照病毒的细胞比较均显著下降（图6），表明FKN基因敲低能显著抑制HK-2细胞的活力。

6 FKN基因敲低促进HK-2细胞凋亡

AnnexinV-PI双染流式细胞术检测显示，在病毒感染48h后，感染LV-FKN-RNAi的HK-2细胞凋亡率明显高于感染对照病毒的细胞分（图7）。

图5 LV-FKN-RNAi感染对HK2细胞形态的影响。A，正常HK-2细胞；B，感染LV-FKN-RNAi的HK-2细胞；比例尺，100μmFig. 5 Effect of LV-FKN-RNAi infection on morphology of HK2 cells. A, wild type HK2 cells； B, HK2 cells infected with LV-FKN-RNAi； scale bar,100μm

图6 FKN基因敲低对HK2细胞活力的影响。a，与同组内0h比较，P＜0.05；b，同组内与前一时间点比较，P＜0.05；c，与对照组同一时间点比较，P＜0.05. n=3Fig.6 Effect of FKN knockdown on the viability of HK2 cells. a, P＜0.05,vs 0h of the same group； b, P＜0.05, vs the previous time point of the same group； c, P＜0.05, vs the same time point of control group； n=3

图7 FKN基因敲低对HK-2细胞凋亡的影响。A，凋亡率代表性流式细胞术检测结果；B，凋亡率统计学分析；*与空白对照组相比，P＜0.01；n=3Fig. 7 Effect of FKN knockdown on HK-2 cells apoptosis. A, representative result of apoptosis analysed by flow cytometry； B, statistical analysis for apoptosis rate； *P＜0.01, compared with the control； n=3

讨 论

肾脏纤维化是多种原发或继发性肾脏疾病的终末病理过程，以肾小球硬化、肾小管萎缩和间质纤维化、细胞外基质异常增多并过度沉积在肾脏组织为特征[17]，伴有肾功能进行性不可逆损害的病理过程，最终发展为肾衰竭。肾脏间质细胞包括肾间质成纤维细胞、肌成纤维细胞、肾小管上皮细胞、淋巴细胞和巨噬细胞[18]。肾小管上皮细胞是肾脏中数量最多的固有细胞，其异常凋亡和表型转化是多种肾脏疾病重要病理基础[19]。当肾小管上皮细胞受损时，可分泌多种炎症因子和趋化因子参与炎症免疫反应，体外研究证实，HK-2细胞经过TGF-β1刺激后可发生表型转化，具体表现为E钙粘蛋白等上皮表型蛋白表达降低，α平滑肌动蛋白等间充质蛋白及成纤维特异性蛋白-1、间质细胞Ⅰ型胶原等表达增高[20]。Strutz等[21]发现，在抗肾小管基底膜疾病的动物模型HK-2细胞中发现存在成纤维特异性蛋白-1的表达，首次证实上皮间质转分化（epithelial-mesenchymal transiton，EMT）参与肾脏纤维化过程。肾小管上皮细胞转分化是肾间质纤维化的重要发病机理，EMT在肾脏胚胎发育及受损后组织纤维化和重建的过程中发挥关键作用，有研究表明，在小鼠肾间质纤维化过程中，约1/3是通过HK-2细胞EMT发展而来[22]，约35%的成纤维细胞通过内皮细胞间质转分化参与其中。在一项临床试验中，通过分析不同类型肾脏病患者的肾活检病理结果发现，HK-2细胞EMT发生率与肾间质损害程度呈正相关。这些研究结果表明，HK-2细胞和成纤维细胞之间的相互作用在维持正常肾脏发育和纤维化中发挥重要作用[23]。

FKN通过黏附和趋化作用参与介导炎症过程和免疫反应，几乎参与所有肾脏疾病的发生发展。在HK-2细胞中，FKN分布与细胞顶膜部，主要发挥募集白细胞的作用[24]。TNF-α刺激HK-2细胞后可诱导FKN表达水平上升[25]，在肾小管间质炎症过程中，FKN主要通过募集白细胞参与小管受损后的再生过程，这表明FKN在肾小管间质发病机制中发挥重要作用。我们课题组前期研究结果发现，在狼疮性肾炎患者外周血中FKN表达水平显著增高，在肾脏组织中主要分布在肾小球、肾小管、足细胞、内皮细胞中[26,27]。在糖尿病肾病中，FKN和C反应蛋白（C-reactive protein，CRP）水平均明显高于健康对照组，可能是由于高血糖状态下，糖基化终产物和细胞因子活化诱导FKN表达量增高[28-30]，这表明FKN参与了糖尿病肾病的发病机制。因此我们猜测，FKN可能是降低HK-2细胞损伤并延缓多种肾脏疾病纤维化过程的重要靶点。为了进一步探讨FKN的具体作用，为肾脏疾病细胞治疗提供可靠的稳定细胞系，本实验成功构建了FKN低表达慢病毒载体（LV-FKN-RNAi）。并分别感染HK-2细胞，通过慢病毒感染预实验确定最佳感染条件，随后经过Western blot验证FKN的蛋白表达水平，结果证实成功敲低HK-2细胞中FKN蛋白表达水平。随后我们又进一步对细胞功能进行检测，证明FKN基因低表达能够显著降低HK-2细胞活力，增加细胞凋亡。

本研究的主要价值在于建立了一种有效的体外转基因研究工具，为深入探讨FKN在HK-2细胞损伤中的具体发病机制奠定基础。本次实验目的在于验证慢病毒工具的可行性及可靠性，及对感染HK-2细胞的增殖、凋亡、自噬等方面进行深入研究。这为以后针对FKN在肾脏疾病发病机制中的研究奠定科学基础。