上皮细胞向间充质细胞转变在肝癌进程中的作用

崔宏伟， 苏秀兰

（内蒙古医科大学附属医院临床医学研究中心，呼和浩特 010050）

国际癌症研究机构（IARC）肿瘤监察组的Freddie Bray博士近期研究报告指出，2018年全球死亡率最高的四种癌症分别是：肺癌（18.4%）；结直肠癌（11.6%）；胃癌（8.2%）；肝癌（8.2%）[1]。长期酗酒，摄入黄曲霉毒素，感染乙型（HBV）或丙型肝炎病毒（HCV），长期高脂饮食均可导致肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）发展[2]。研究显示，HCC从具有微小遗传变异的发育不良病变到晚期阶段的连续演变进程中，显示出显著的分子异质性[3]。HCC通过上皮细胞类型的肝细胞和肝祖细胞的肿瘤转化表现为细胞水平的异质性。这种异质性通常伴随着上皮细胞可塑性的变化，即被称为上皮细胞向间充质细胞转变（epithelial to mesenchymal transition, EMT）。顾名思义，EMT过程是将上皮细胞转化为已进入沿上皮（E）与间充质（M）轴排列的更多间充质细胞状态的细胞[4]。既往研究显示，EMT 相关基因在原发HCC肿瘤局部浸润的边缘表达增高且EMT 发生与HCC肿瘤转移的早期阶段密切相关[5,6]。此外，EMT 的进展破坏上皮细胞极性，使上皮细胞间连接紊乱，促进细胞迁移和侵袭能力，导致癌细胞在从原发肿瘤转移到扩散位点的过程中得以生存下来[7,8]。在本综述中，作者将阐述EMTMET在肝癌进程中的重要性以及肝星状细胞的可塑性对肝癌细胞异质性的影响。同时，概述最近在识别影响重要EMT转录因子的临床诊治方面取得的进展。

1 EMT的特征

EMT是一种自然发生在胚胎发育阶段和广泛的组织类型的细胞生物学程序。EMT是驱动上皮细胞瞬时和可逆性去分化为间充质样或间充质表型的细胞机制[9-11]。EMT诱导上皮细胞可塑性发生变化表现为上皮细胞标志物，如E-钙粘蛋白、细胞角蛋白（K8，K18，K19）表达缺失，间充质蛋白如N-钙粘蛋白，α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA），成纤维细胞特异性蛋白（FSP-1）和EMT转录因子Snail（SNA1），Slug（SNA2），Twist和ZEB表达增强[12,13]。具有诱导性但并未完全EMT的上皮细胞被称为“部分”EMT，并且在该去分化阶段的细胞共表达上皮细胞标记物和间充质标记物。部分和完全EMT均可通过间充质至上皮转换（MET）逆转，从而恢复上皮细胞特征。在乳腺癌和结肠癌及肿瘤在肝内和肝外转移进展中，EMT-MET是肿瘤转移性定植所必需的[14]。另一方面，EMT对于肿瘤化学敏感性至关重要。如胰腺导管腺癌，其中Snail或Twist的缺失并不能阻止肿瘤的侵袭和转移，但会使胰腺癌细胞对吉西他滨治疗敏感，从而增加荷瘤小鼠的存活时间[15]。

目前，我们通过部分和完全EMT可评估恶性上皮肝细胞的各种EMT表型并逆转MET，以及HCC的复杂性和肝癌细胞的异质性。不过，这很难通过体内细胞成像手段来实现。在这种情况下，部分发生癌变的肝细胞在诱导后，由上皮细胞或间充质样细胞发生部分EMT，或者完全EMT为间充质细胞，很难与纤维化组织中的肝星状细胞（HSC）衍生的肌成纤维细胞区分。但这些细胞表型可以在MET的任何阶段发生逆转(图1A)[16]。

2 肝纤维化和HCC中的EMT进程

受损的上皮细胞被认为是主要参与肺和肾组织纤维化的纤维母细胞的重要来源，而EMT在肝实质细胞发展为肝纤维化进程中的作用存在争议[17]。虽然原代肝细胞和胆管细胞可以通过转化生长因子β（TGF-β）或Hedgehog在体外诱导发生EMT，但在肝纤维化期间EMT在体内的作用存在争议[18]。最初，在CCl4诱导的肝纤维化期间，在白蛋白启动子驱动的LacZ转基因细胞中检测到FSP-1阳性表达的肌成纤维细胞，表明肝细胞的上皮可塑性发生变化，而未检测到肝细胞向表达胶原1/GFP或FSP-1/GFP的肌成纤维细胞的转化[19,20]。

Iwaisako等认为，肌成纤维细胞来源于肝毒性损伤的肝星状细胞或胆汁性肝损伤的门静脉成纤维细胞，而不是来自肝细胞的EMT[21]。Pinzani则提出了“逃逸反应”模型用于肝损伤期间肝细胞的EMTMET解释，即未转化的肝细胞在炎症、缺氧和氧化还原激活的微环境刺激下，应激获得运动能力更强的间充质表型，快速移动并逃脱损伤和凋亡，最终通过MET样过程恢复上皮表型。Pinzani的“逃逸反应”模型强调的是，肝细胞的可塑性在慢性肝损伤期间可以抵消肝纤维化发生而不是促纤维化进程[22]。在晚期HCC进程中，恶性肿瘤中心由于氧耗及细胞坏死较肿瘤基质边界加剧，这与Pinzani提出的慢性肝损伤期间“逃逸反应”模型中假设的EMT条件相当，促使恶性肝细胞或肝祖细胞的EMT转化产生的间充质子代细胞具有抗细胞凋亡和迁移性状，以抵抗细胞死亡刺激并向细胞因子/趋化因子富集的微环境发展[23]。在HCC小鼠模型中，致癌因子HRas和TGF-β协调促进小鼠肝细胞EMT进程，而在HCC患者中，层粘连蛋白-5和TGF-β的活化促进EMT进程。这提示，TGF-β为最有效的EMT诱导剂之一[24,25]。研究表明，TGF-β在HCC进展中具有双重作用，即在肿瘤发展的早期起抑癌作用，但在促进EMT和癌症转移的后期阶段发挥致癌作用[26]。然而，TGF-β因子的功能从肿瘤抑制转变为肿瘤促进的分子机制仍然不清楚。Coulouarn等研究显示，TGF-β-阳性HCC患者的“晚期TGF-β特征”与侵袭性表型和HCC转移相关[27]。因此，TGF-β被认为是导致HCC进展的EMT的关键途径。

3 EMT在HCC中的作用机制

在HCC进程中，EMT进程涉及EMT-TF激活的多个关键因子，包括SNAI家族的成员Snail（SNA1）和Slug（SNAI2），Twist家族的Twist1，Twist2，E12，E47和ID以及ZEB家族ZEB1和ZEB2[28,29]。（1）SNAI家族。Snail是HCC中有效的EMT诱导剂。研究显示，Tat相互作用蛋白30（TIP30）通过与importin-β2相互作用阻断Snail入核，从而阻断HCC细胞发生EMT。而TIP30的缺乏，会导致核内Snail积累和E-钙粘蛋白表达抑制[30]。受体酪氨酸激酶（RTK）Axl通过与14-3-3ζ结合及TGF-β信号传导的分子协作而表达上调，从而诱导Snail表达[31]。另有研究表明，异种核糖核蛋白AB（HNRNPAB）在转移性HCC细胞中过表达，活化Snail诱导EMT。干扰Snail可降低HNRNPAB的表达，逆转HNRNPAB促进的HCC转移[32]。肝细胞核因子（HNF）4α可以与T细胞因子4（TCF4）结合，消除了β-连环蛋白/ TCF4的转录活性，从而下调Snail / Slug表达并维持上皮表型[33]。（2）Twist家族。p28（GANK）（gankyrin）表达增高的HCC通过激活磷酸肌醇3-激酶（PI3K）/ Akt /缺氧诱导因子（HIF）-1α信号传导通路促进具有增强血管内皮生长因子（VEGF）表达导致肿瘤血管生成，侵侵袭和转移的Twist1生成，从而表现出EMT[34]。Twist诱导的EMT激活的另一个机制取决于通过TGF-β1或表皮生长因子（EGF）下调脂质运载蛋白（Lcn2）的表达[35]。此外，因吉西他滨干预导致获得性耐药性增强的HCC细胞表现出EMT，导致血小板衍生生长因子（PDGF）-D和Twist1的表达增强[36]。（3）ZEB家族。研究表明，FoxQ1通过直接结合ZEB2启动子区域诱导EMT[37]。lncRNA小核仁RNA宿主基因20（SNHG20）可以与EZH2的增强子结合并调节EMT标志物E-钙粘蛋白的表达，从而促进EMT和HCC的侵袭[38]。进一步的研究表明，lncRNA ZEB1-AS1通过调节上皮间充质细胞转变诱导标志物E-cadherin、N-cadherin的表达水平与HCC肿瘤生长和转移的减少有关[39]。

此外，另外的miR-200家族成员在HCC进展期间发挥重要作用。miR-216a/217的表达与EMT相关，其靶向调控PTEN和SMAD7激活PI3K / Akt和TGF-β信号传导，导致HCC患者存活率低[40]。Dhayat等研究提示，MiR-200a和miR-200b在HCC中显着下调，其表达与间充质标志物Vimentin和ZEB-1的表达呈显著负相关，与E-钙粘蛋白表达正相关[41]（图1B）。

图1 HCC进展中细胞异质性的EMT-MET过程及影响EMT-TFs的关键调节因子。a，恶性肝细胞或肝祖细胞通过部分或完全EMT-MET的分化，促进HCC细胞的镶嵌表型及慢性肝病中肝细胞的可塑性发生变化；b，肝EMT与HCC进程中，多种参与下调E-cadherin导致EMT发生的激活或者抑制的Snail、Twist、ZEB转录因子Fig. 1 EMT-MET process of cell heterogeneity in HCC progression and key regulators that affect EMT-TFs. A, malignant hepatocytes or progenitor cells promote the mosaic phenotype of HCC cells and the plasticity changes of hepatocytes in chronic liver diseases by partial or complete EMT-MET；B, in the EMT and HCC process of liver, multiple transcription factors including Snail, Twist, ZEB transcription factors involve in down-regulating E-cadherin and lead to activation or inhibition of EMT.

4 EMT在HCC临床诊断中的作用

目前，EMT如何影响HCC患者临床结局的研究主要受到两个因素的限制。首先，缺乏对EMT定义的统一共识。由于每项研究通常使用不同的实验技术和试剂，且只是报告一些公认的EMT标记物的变化情况。由于对HCC组织采用不同的处理方式，如冷冻切片或者石蜡包埋切片，使得β-连环蛋白（一种重要的EMT标记物）的表达情况不同。可能是由于不同的组织固定技术扰乱蛋白质结构和免疫靶向性能。所以，大多数研究集中于对E-钙粘蛋白的表达，调节和功能的研究报道[42-44]。另一个限制是，冰冻切片观察HCC组织的病理形态很难对应于HCC进程中EMT的多步骤动态过程。此外，循环肿瘤细胞（CTC）检测技术新近应用于包括HCC在内的癌症中的EMT的测定。根据CTC细胞的定义，这些CTC细胞具有较强的迁移能力，并且由于EMT刺激而更具侵袭性和恶性表型[45]。Li等从60例HCC患者中的46例获得的外周血中检测到CTC。其中，32例（69.6%）可检出CTC中Twist和vimentin的共表达，并与门静脉癌栓，TNM分类和肿瘤大小高度相关。最后认为EMT在促进原发性HCC细胞的血液传播中起作用，并且CTC中的Twist和vimentin表达水平可以作为评估HCC患者转移和预后的有潜力的生物标志物[46]。

5 EMT在临床治疗中的意义

HCC患者化疗过程产生的化疗药物耐药性的分子机制一直是肿瘤治疗研究的重点。EMT可能影响HCC的治疗效果，而治疗本身又诱导肿瘤组织重塑进而引发EMT进程。比如经动脉化学栓塞（TACE）治疗引发的缺氧导致较强EMT诱导作用的HIF-1α表达上调[47]。Liu等在TACE治疗引发缺氧的小鼠模型也得到同样结果[48]。Ogunwobi等研究指出，肝细胞生长因子（HGF）上调COX-2和Akt的表达促进EMT和HCC进程[49]。现已证实c-Met抑制剂tivantinib在表达更高水平的c-Met 的HCC患者的II期临床试验中提高了患者的总体存活率[50]。另一个针对EMT治疗的理想靶点是TGF-β，因为TGF-β是一种有效的EMT诱导剂。Galunisertib是TGF-β受体I激酶的一种小分子抑制剂，EMT在HCC进程中的作用可阻断TGF-β的经典和非经典途径[51]。在不同的临床前期实验中，galunisertib通过逆转EMT过程显示出抗肿瘤作用。同时，它还改善了周围组织微环境的整体稳态，包括调节肿瘤周围的促纤维增生反应，从而中断HCC通常发展的基质-肿瘤相互作用[52]。

6 结论与展望

综上所述，EMT在HCC发展中起着关键作用。但EMT在肝纤维化进程中的作用仍存在争议。因此，EMT调节剂是HCC的潜在治疗靶点。目前，在形态学水平上很难识别EMT过程，从而阻碍了EMT相关生物标志物在临床实践的鉴定。不过靶向调控EMT诱导分子如c-Met和TGF-β的新疗法正在进入临床验证阶段。这些研究将有助于阐明EMT的分子机制并促进调控EMT的临床实验。尤其是在未来的个性化医疗环境中，c-Met、TGF-β及E-钙粘蛋白水平能够预估HCC患者的预后情况，从而有针对性的开展抑制EMT诱导分子如TGF-β途径的治疗。