单性木兰总黄酮的含量测定及提取条件优化

郑燕菲 覃小静 蔡杰慧

摘 要 对单性木兰叶中总黄酮的含量及其提取条件进行研究。结果表明，采用硝酸铝显色法建立了总黄酮的定量分析方法;采用L9（34）正交试验表优化提取条件，在最佳提取条件乙醇浓度60%、提取温度80 ℃、料液比1∶25、提取时间150 min下，单性木兰叶总黄酮得率为2.76%。试验结果对濒危植物单性木兰成分的研究和产品开发，具有重要的指导作用。

关键词 单性木兰;总黄酮;含量测定

中图分类号：R284.2 文献标志码：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2019.14.065

单性木兰，为木兰科单性木兰属，是我国特有的珍稀濒危植物，仅分布于我国西南地区，在广西壮族自治区已有人工种植林。单性木兰叶化学成分的研究只有挥发油、多糖和多酚等，而总黄酮的研究鲜见报道。若能把濒危植物单性木兰叶作为原料，提取获得天然的黄酮类化合物，开发成为天然的抗氧化剂和具有保健功能的食品添加剂，对提高该植物的综合利用价值具有重大意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

原料：新鲜单性木兰叶摘自广西壮族自治区南宁市武鸣区，经广西大学林学院赖家业教授鉴定为木兰科单性木兰属植物单性木兰。

试剂：芦丁为标准品;石油醚、无水乙醇、氢氧化钠、亚硝酸钠以及硝酸铝等试剂均为分析纯;试验用水为蒸馏水。

仪器：DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器，RE-3000B旋转蒸发器，AR224CN型电子天平，722型分光光度计。

1.2 试验方法

1.2.1 芦丁标準曲线的绘制

向5支10 mL容量瓶中准确移入0.131 0 mg·mL-1的芦丁标准溶液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL，分别加入0.72 mol·L-1 NaNO2溶液0.3 mL，摇匀后放置6 min，再分别加入0.47 mol·L-1 Al（NO3）3溶液0.3 mL，摇匀后放置6 min，加入1 mol·L-1 NaOH溶液4.0 mL摇匀，用蒸馏水定容至刻度，摇匀并静置15 min，在510 nm波长处测定吸光值，并绘制标准曲线。

1.2.2 单性木兰叶总黄酮提取液的制备

将新鲜单性木兰叶洗净、干燥、粉碎，取适量粉末于圆底烧瓶中，加入料液比为1∶4 g·mL-1的石油醚，于70 ℃回流240 min脱色除脂，挥去溶剂、烘干得单性木兰叶脱脂原料;称取一定量的单性木兰叶脱脂原料置于250 mL圆底烧瓶内，加入一定料液比的不同溶剂，在不同温度条件下加热回流一定时间后，离心，过滤，上清液即为单性木兰叶总黄酮提取液。

1.2.3 单性木兰叶总黄酮的含量测定

分别移取不同的单性木兰叶总黄酮提取液1.0 mL，按照1.2.1的操作测定吸光值，计算单性木兰叶总黄酮的得率。

1.2.4 单性木兰叶总黄酮工艺优化

考察乙醇浓度、料液比、提取温度和提取时间4个因素对单性木兰叶总黄酮得率的影响，计算总黄酮得率。准确称取单性木兰叶脱脂原料5.0 g，分别以乙醇浓度（50%、60%、70%、80%、95%）、液料液比（1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40）、提取温度（50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃）以及提取时间（60 min、90 min、120 min、150 min、180 min）为影响因素进行试验。

利用单因素试验的结果，选择4个提取因素（A：乙醇浓度;B：料液比;C：温度;D：时间）进行L9（34）正交试验，并进行方差分析，确定单性木兰叶总黄酮提取的最佳条件。

2 结果与分析

2.1 定量方法的确定

以芦丁标准溶液的质量浓度X为横坐标，吸光值Y为纵坐标，绘制芦丁标准曲线，并进行线性拟合，结果为芦丁标准溶液在质量浓度0.013 1～0.065 5 mg·mL-1范围内与吸光值呈良好的线性关系，线性方程为Y=13.847X+0.003 2，R2=0.999 8。经精密度、稳定性及加标回收试验。

2.2 单因素试验结果

单因素试验结果如图1所示。单性木兰叶总黄酮得率随着乙醇浓度的增大呈先升后降的趋势，乙醇浓度为70%时达到最大。黄酮类物质的溶解性与溶剂极性有关，当乙醇与水的比例适宜时，总黄酮的溶解度最大，故选70%的乙醇作为最佳溶剂。总黄酮的得率随着料液比的增大而增大，溶剂的量越大，细胞里外浓度差越大，黄酮类物质越容易被提取。当料液比为1∶30时得率达到最大，之后得率不再变化。所以，从节约成本、试验操作方面考虑，选择料液比为1∶25为最佳提取液固比。单性木兰叶中总黄酮的得率随着温度的升高而增大，当温度达到70 ℃时得率达到最大值，70 ℃后得率逐渐降低。这是因为温度过低黄酮类物质不易被溶出，而温度过高黄酮类物质会发生氧化、缩合等化学反应，故选择70 ℃作为提取的最佳温度。总黄酮的得率随着时间的增大而增大，提取时间为120 min时得率达到最大，超过120 min后得率保持不变，故选择120 min作为最佳的提取时间。

2.3 正交试验结果

L9（34）正交试验安排与结果，如表1所示。

由表1可知，影响单性木兰叶中总黄酮得率的4个因素的主次顺序是：A>C>B>D。单性木兰叶中，总黄酮的最佳提取条件为A1C3B2D3，即乙醇浓度60%、提取温度80 ℃、料液比1∶25、提取时间150 min。在此最佳条件下进行验证，平行提取5次，提取率分别为2.74%、2.76%、2.76%、2.74%和2.78%，平均值为2.76%，且RSD值为0.61%，说明正交试验结果准确可靠。

3 结论与讨论

以芦丁为标准品，采用硝酸铝显色法建立总黄酮的定量分析方法，得标准曲线方程Y=13.847X+0.003 2;采用L9（34）正交试验设计方法优化提取条件，得单性木兰叶总黄酮最佳提取条件为乙醇浓度60%、提取温度80 ℃、料液比1∶25、提取时间150 min。在此条件下，单性木兰叶总黄酮得率为2.76%。本试验首次对单性木兰叶总黄酮含量进行测定及其提取工艺进行优化，具有一定的前瞻性，为濒危植物单性木兰的进一步研究和开发奠定了基础。

（责任编辑：刘昀）