秘鲁鱿鱼吸盘环齿脱离工艺条件优化及其结构特性分析

叶 开 陈小娥,* 袁高峰 郭 健 方旭波 池海波 张 华

(1 浙江海洋大学食品与医药学院，浙江 舟山 316022；2 舟山市海利远洋渔业有限公司，浙江 舟山 316000)

秘鲁鱿鱼(Dosidicusgigas)是美洲大赤鱿的俗称，是目前发现的个体最大、资源最丰富的掠食性鱿鱼种类之一[1]。秘鲁鱿鱼个体大，味道较酸涩，必须通过精深加工才能实现资源增值[2]。目前，国内鱿鱼深加工主要集中在胴体、须和鳍上，忽视了对加工副产物的利用[3]。鱿鱼吸盘是秘鲁鱿鱼须的加工副产物，由于鱿鱼吸盘内含有环齿，且吸盘和环齿咬合程度较高，脱离难度大，导致其难以被有效加工利用，企业只能将它作为鱼粉的原料低价出售[4]。但国外专家学者发现秘鲁鱿鱼吸盘环齿具有独特的功能性质，Miserez等[5]以能量色散X射线光谱等方法对秘鲁鱿鱼吸盘环齿进行研究，发现其不同于其他已发现的生物结构材料，由氢键和疏水相互作用保持结构稳定，可应用于生物材料领域；Latza等[6]研究发现秘鲁鱿鱼吸盘环齿具有良好的机械性能；Knowles等[7]从秘鲁鱿鱼吸盘环齿提取的环齿蛋白短肽，可用于制备功能性淀粉样蛋白基材料，但有关秘鲁鱿鱼吸盘环齿酶法脱离工艺及其结构特性的研究尚鲜有报道。因此，本研究以秘鲁鱿鱼须加工副产物-鱿鱼吸盘为原料，首次用蛋白酶酶解鱿鱼吸盘脱环齿的方法，结合单因素试验，利用响应面法对其酶解脱环齿工艺条件进行优化，并通过红外光谱分析、扫描电镜和热稳定性分析等方法对秘鲁鱿鱼吸盘环齿的结构特性进行深入分析，以期为有效开发利用鱿鱼吸盘环齿提供理论依据和新的研究方向。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

原料：冷冻秘鲁鱿鱼吸盘，由舟山海利远洋渔业有限公司提供。

试剂：标准牛血清蛋白，美国Sigma公司；甲壳素，上海生工生物工程有限公司；木瓜蛋白酶(100 000 U·g-1)、胰酶(4 000 U·g-1)、菠萝蛋白酶(100 000 U·g-1)、胃蛋白酶(20 000 U·g-1)，南宁庞博生物工程有限公司；氢氧化钠、盐酸等其他试剂均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 主要仪器与设备

Nicolet 6700红外光谱仪，美国Thermo Nicolet公司；HH-4型电热恒温水浴锅，常州国华电器有限公司；LGJ-10冷冻干燥机，北京松源华兴科技发展有限公司；DFT-250高速万能粉碎机，上海楚定分析仪器有限公司；Phenom Pure台式扫描电子显微镜，复纳科学仪器上海有限公司； 200 F3型差示热扫描仪，德国耐驰公司。

1.3 试验方法

1.3.1 酶法脱离秘鲁鱿鱼吸盘环齿试验

1.3.1.1 原料预处理 将冷冻的秘鲁鱿鱼吸盘流水解冻，清洗干净，备用。

1.3.1.2 酶的筛选 选取木瓜蛋白酶、胰酶、菠萝蛋白酶和胃蛋白酶4种酶对秘鲁鱿鱼吸盘进行酶法脱离吸盘环齿。酶解条件为：酶添加量1 000 U·g-1、料液比1∶15 g·mL-1，不同蛋白酶各自最适pH值与酶解温度条件(表1)下酶解30 min，结束后测其脱齿率，平行试验3次，通过比较鱿鱼吸盘脱齿率大小，筛选出最适的酶进行下一步试验。

表1 蛋白酶的最适酶解条件Table 1 Optimal enzymatic hydrolysis conditions of proteases

1.3.1.3 单因素试验设计 设置料液比1∶15 g·mL-1、酶添加量1 000 U·g-1、酶解温度40℃、pH值7.0值、酶解时间30 min为初始基础条件，以脱齿率为指标，进一步考察酶添加量 (500、1 000、1 500、2 000、2 500 U·g-1)、酶解时间(10、20、30、40、50 min)、酶解温度(30、40、50、60、70℃)对秘鲁鱿鱼吸盘环齿脱离效果的影响。每试验重复3次。

1.3.1.4 响应面优化试验设计 在单因素试验的基础上，以脱齿率为响应值，酶添加量(A)、酶解温度(B)、酶解时间(C)为考察因素，采用软件Design-Expert V8.0.6对木瓜蛋白酶酶法脱环齿的条件进行优化。响应面试验设计与因素水平见表2。

1.3.1.5 鱿鱼吸盘环齿脱齿率的计算 以秘鲁鱿鱼吸盘环齿(sucker ring teeth, SRT)与吸盘肌肉组织完全分离视为已脱齿，反之为未脱齿，按照公式计算脱齿率：

(1)

式中，W1为已脱齿秘鲁鱿鱼吸盘的数目；W为秘鲁鱿鱼吸盘总数。

表2 响应面试验因素水平表Table 2 Factors and levels of response surface experiment

1.3.2 秘鲁鱿鱼吸盘环齿基本成分的测定 按照国标GB 5009.3-2010[8]中直接干燥法测定水分含量；按照国标GB 5009.5-2016[9]中凯氏定氮法测定蛋白质含量；按照国标GB 5009.4-2016[10]中高温灼烧法测定灰分含量。

1.3.3 秘鲁鱿鱼吸盘环齿的红外光谱分析 参照官爱艳等[11]的方法。将鱿鱼吸盘环齿粉碎后取环齿粉末在玛瑙研钵中进一步研磨，得环齿粉末。环齿粉末与干燥溴化钾(KBr)粉末按质量比约1∶100在玛瑙研钵中研磨混匀，将研磨均匀的粉末放于模具中，均匀加压，得到薄且透明的待测样片，然后使用红外光谱仪进行扫描测试，光谱范围为4 000～400 cm-1。牛血清白蛋白(bovine albumin，BSA)与甲壳素(chitin)样品按照上述步骤磨成粉末后进行红外光谱分析。

1.3.4 秘鲁鱿鱼吸盘环齿微观结构观察 切取秘鲁鱿鱼吸盘环齿截面，用去离子水浸泡过夜以除去残留盐，干燥后按照王绍清等[12]的方法进行扫描电镜观察。将样品黏着于导电胶带上，喷金处理后，置于电镜样品仓中进行形态扫描，并对扫描后的图片进行成像分析。

1.3.5 秘鲁鱿鱼吸盘环齿的热稳定性分析 参照高必成等[13]的差示扫描量热法(differential scanning calorimetry，DSC)。将秘鲁鱿鱼吸盘环齿用研钵均匀研磨后取适量吸盘环齿粉末，置于DSC坩埚中，加盖密封后，以空坩埚作为参比，从30℃升温至300℃，升温速率为10℃·min-1，N2为保护气。

1.3.6 秘鲁鱿鱼吸盘环齿的耐酸碱性测试 参照夏锟峰等[14]的方法。将HCl、NaOH和NaHCO3分别配制为pH值依次为2、4、6、7、8、10、12的溶液，再将待测样品在60℃真空中干燥至恒重后称量(M)，分别放入上述已配置好溶液中，浸泡处理2 h后取出用去离子水洗净，干燥至恒重后称量(m)，每试验设3次平行。按照公式计算鱿鱼吸盘环齿的质量损失率：

(2)。

1.3.7 数据分析 试验结果以平均值±标准差表示(n=3)，并利用SPSS 19.0进行差异性检验和回归分析，显著性水平P<0.05。依据试验数据，采用Origin Pro 8.0软件绘制图形。

2 结果与分析

2.1 不同蛋白酶对秘鲁鱿鱼吸盘环齿脱齿率的影响

酶具有高效、专一性，在很大程度上会影响酶解效果。由图1可知，木瓜蛋白酶处理的鱿鱼吸盘脱齿率最高，达78.2%，其次是胰蛋白酶和菠萝蛋白酶，胃蛋白酶效果最差。因此，选择木瓜蛋白酶作为最适蛋白酶并应用于下一步试验。

注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。Note: Different lowercase letters indicate significant difference at 0.05 level. The same as following.图1 不同蛋白酶对秘鲁鱿鱼吸盘环齿脱齿率的影响Fig.1 Effect of several enzymes on isolation rate of Dosidicus gigas SRT

2.2 单因素试验结果

2.2.1 酶添加量对秘鲁鱿鱼吸盘环齿脱离效果的影响 由图2可知，随着酶添加量的增加，秘鲁鱿鱼吸盘环齿脱齿率逐渐升高，这是因为在底物浓度一定时，酶量增加，吸盘肌肉组织蛋白分子与酶的接触会增多，吸盘肌肉组织蛋白水解更充分，秘鲁鱿鱼吸盘环齿脱齿率也随之上升[15]。当加酶量继续增加至1 500 U·g-1时，酶逐渐达到饱和浓度，继续增加酶量，鱿鱼吸盘环齿脱齿率变化不大。因此，选用1 500 U·g-1作为酶的适宜添加量。

图2 酶添加量对秘鲁鱿鱼吸盘环齿脱齿率的影响Fig.2 Effect of enzyme dosage on isolation rate of Dosidicus gigas SRT

2.2.2 酶解温度对秘鲁鱿鱼吸盘环齿脱离效果的影响 由图3可知，酶解温度从30℃上升到40℃时，酶活性增加，秘鲁鱿鱼吸盘环齿的脱齿率也逐渐升高。酶解温度为40℃时，鱿鱼吸盘环齿的脱齿率最高，达80.2%；当酶解温度超过40℃后，鱿鱼吸盘环齿会变得柔韧而难以与吸盘肌肉分离，脱齿率降低；当温度超过60℃时，蛋白酶会逐渐变性失去活性从而使脱齿率偏低[16]。因此，酶解温度应在40℃左右为宜。

图3 酶解温度对秘鲁鱿鱼吸盘环齿脱齿率的影响Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on isolation rate of Dosidicus gigas SRT

2.2.3 酶解时间对秘鲁鱿鱼吸盘环齿脱离效果的影响 由图4可知，酶解时间在30 min内时，秘鲁鱿鱼吸盘环齿的脱齿率呈上升趋势。当酶解时间为30 min时，鱿鱼吸盘环齿脱齿率达到最大，为81.1%，随后趋于平缓，这可能是因为酶解反应刚开始时，酶浓度比较高，酶与底物接触面积较大，酶解速度较快，因此脱齿率增加幅度较大[17]，但随着酶解反应的进行，酶量减少，酶活力下降，故鱿鱼吸盘环齿脱齿率的增加趋势逐渐平缓[18]。因此，酶解时间为30 min左右为宜。

图4 酶解时间对秘鲁鱿鱼吸盘环齿脱齿率的影响Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis time on isolation rate of Dosidicus gigas SRT

2.3 秘鲁鱿鱼吸盘环齿酶解脱齿工艺条件的优化

以脱齿率(W)为响应值进行响应面优化试验，响应面的试验方案设计与结果见表3。

表3 响应面试验方案设计与结果Table 3 Experimental design and results of response surface methodology

利用Design-Expert V8.0.6对响应面试验结果进行分析，拟合得到二次回归方程为：W=48.08+2.25A+4.21B+3.79C+0.62AB+0.45AC-0.70BC-4.14A2-7.82B2-4.76C2。

对上述二次回归方程进行方差分析，由表4可知，回归模型极其显著(P<0.000 1)，失拟项不显著(P=0.056 2>0.05)，模型的相关系数R2=0.996 2，说明模型拟合程度良好，因此，可以用此模型对秘鲁鱿鱼吸盘环齿酶法脱离的工艺条件进行分析预测。各项系数P值的分析表明，因素A、B、C、A2、B2、C2、BC均达到极显著水平(P<0.01)。由F值的大小可以推断，在所选择的试验范围内，3个考察因素对酶解脱离鱿鱼吸盘环齿效果的影响顺序为：酶解温度(B)>酶解时间(C)>酶添加量(A)。相应曲面分析、因素之间的交互作用见图5。由图5可知，当酶添加量保持不变时，随着酶解温度的增加，秘鲁鱿鱼吸盘环齿脱齿率呈现先升高后下降的抛物线趋势，存在最大值，即存在最佳的酶解温度。同样，随着酶解时间和酶添加量的变化，秘鲁鱿鱼吸盘环齿脱齿率也呈相应的抛物线变化趋势，即这两者存在最佳值能使脱齿率达到最大。因此，在试验选定的因素水平区间内有最佳的酶解条件组合，使得秘鲁鱿鱼吸盘的脱齿率达到最大。通过模型和响应面曲线图，确定秘鲁鱿鱼吸盘酶法脱离环齿较理想的工艺参数为：酶添加量1 703 U·g-1、酶解温度42.82℃、酶解时间34.39 min，预测模型的脱齿率为96.2%。结合实际操作情况，调整为酶添加量1 700 U·g-1、酶解温度43℃、酶解时间34 min，在此条件下，进行3次重复性试验，得到脱齿率为96.2%±1.8%，与预测值96.2%接近，说明该模型拟合数据良好，能较好预测秘鲁鱿鱼吸盘脱齿率。

2.4 秘鲁鱿鱼吸盘环齿的主要成分分析

对秘鲁鱿鱼吸盘环齿的主要成分进行测定，结果表明，秘鲁鱿鱼吸盘环齿主要由蛋白质组成，其蛋白含量高达86.75%。此外，鱿鱼吸盘环齿的水分含量、灰分含量分别为12.86%、0.37%。

2.5 秘鲁鱿鱼吸盘环齿红外光谱分析

由图6可知，秘鲁鱿鱼吸盘环齿谱图与牛血清蛋白类似，具有蛋白类物质的特征吸收峰(3 421、1 644、1 544、1 116 cm-1)[19]。其中3 421 cm-1附近的强吸收峰为蛋白质类O-H的伸缩振动峰；2 918 cm-1附近的吸收峰是C-H的伸缩振动峰；1 640 cm-1附近的吸收峰是C=O的伸缩振动峰[20]；1 544 cm-1和1 457 cm-1附近的吸收峰分别为酰胺2带中N-H面内弯曲振动峰及C-N伸缩振动峰；1 230 cm-1和1 116.58 cm-1附近的吸收峰分别为酰胺3带中N-H面内弯曲振动峰和C-N伸缩振动峰[21]。

图5 各因素及其交互作用对秘鲁鱿鱼吸盘环齿脱齿率的影响Fig.5 Effects of interaction between the reaction factors on isolation rate of Dosidicus gigas SRT

与甲壳素的红外图谱对比分析发现，秘鲁鱿鱼吸盘环齿样品中未出现甲壳素的特征峰(2 934.65、2 871.61 cm-1)，表明秘鲁鱿鱼吸盘环齿中不存在甲壳素成分，这与鱿鱼另一个坚硬组织喙不一样，鱿鱼喙中的甲壳素含量达15%～20%，是其主要的组成部分之一[22-23]。

2.6 秘鲁鱿鱼吸盘环齿外观及微观结构观察

由图7-A可知，秘鲁鱿鱼吸盘环齿呈环状，由基底环和一系列牙列组成，颜色为黄褐色。由图7-B、C可知，秘鲁鱿鱼吸盘环齿的微观结构呈平行管状构造，该构造会直接影响到环齿的机械性能，由于吸盘环齿分布于鱿鱼须和触手位置，该位置被用于捕获猎物，通常要求能承受很大的机械载荷，而吸盘环齿的平行管状结构能增强环齿的弯曲刚度，使其能够承受很大的弯曲力或剪切力[24]。

由图7-D可知，秘鲁鱿鱼吸盘环齿也具有多孔结构，其孔隙度通常高达80%～90%，相对连续介质材料，它具有相对密度低、重量轻等特点[25]。同时，秘鲁鱿鱼吸盘环齿的孔隙呈梯度分布，这使其具有梯度硬度的特征(即在齿边缘硬度最高，后朝向环齿基底内部逐渐变软)[26]。此外，多孔结构还能使秘鲁鱿鱼吸盘环齿在其构成介质之间形成防裂机制，以增强其结构的稳定性[21]。

表4 回归模型的方差分析Table 4 Varlance analysis of the regresslon model

注:*表示差异显著(P<0.05)；**表示差异极显著(P<0.01)。

Note:*indicates significant difference at 0.05 level.**indicates extremely significant difference at 0.01 level.

图6 秘鲁鱿鱼吸盘环齿、甲壳素和牛血清蛋白的红外光谱分析图谱Fig.6 Infrared spectra of SRT, chitin and BSA

2.7 秘鲁鱿鱼吸盘环齿热稳定性分析

差示热量扫描仪检测出的曲线图会在最大迁移点处显示出样品的热变性温度。由图8可知，在30～250℃内，氮气流保护下，鱿鱼吸盘环齿在69.4℃左右出现一个吸收峰，这是由于环齿中水分蒸发的物理变化引起的，同时吸盘环齿在约36℃处检测到DSC曲线的斜率出现明显的降低，也说明其内部水分在蒸发[27]；在118.6℃左右有一个吸热峰，表明鱿鱼吸盘环齿在118.6℃以前没有状态变化，性质稳定，而随后由固体变成熔融状态；在218.4℃之后出现一个很明显吸热转变峰，说明在该温度下鱿鱼吸盘环齿中的蛋白二级结构β-折叠受热被破坏。

图7 秘鲁鱿鱼吸盘环齿外观及扫面电子显微镜图Fig.7 Appearance and SEM images of the Dosidicus gigas SRT

2.8 秘鲁鱿鱼吸盘环齿耐酸碱性测试结果

图8 秘鲁鱿鱼吸盘环齿的差示扫描量热法分析曲线Fig.8 Differential scanning calorimetry curves of Dosidicus gigas SRT

材料的耐酸碱性很大程度上决定了材料的耐用性。秘鲁鱿鱼吸盘环齿的主要组成为蛋白质，容易在酸碱条件出现水解。由图9可知，酸性条件下鱿鱼吸盘环齿的质量损失较高，随着pH值的降低，其质量损失率增加；而碱性条件下，鱿鱼吸盘环齿的稳定性相对较好，与酸性条件相比，其质量损失率较小，且质量损失率随着pH值增加而增加。综上表明，秘鲁鱿鱼吸盘环齿在弱酸和弱碱中均具有一定的耐酸碱性，但长时间置于强酸强碱环境中会对其质构等造成较大的损害。

图9 在不同pH值溶液处理2 h时秘鲁鱿鱼吸盘环齿的质量损失率Fig.9 The rate of mass loss of SRT at 2 hours at different pH values

3 讨论

秘鲁鱿鱼吸盘环齿和吸盘咬合紧密，脱离难度大，目前只有手工剥离的方法，但手工剥离速度慢，效率低，且人工成本很高，导致其难以被大规模产业化加工利用。鉴于此，本研究以脱齿率为指标，首次在筛选出适合秘鲁鱿鱼吸盘酶法脱离环齿蛋白酶的基础上，利用单因素和响应面法对其酶解脱环齿工艺条件进行优化，优化后的工艺条件下，秘鲁鱿鱼吸盘的脱齿率达96.2%，且环齿形状保持完整，吸盘肉残留少，与人工剥离相比，酶法脱离速度更快，效率更高。因此，本试验优化后的酶解工艺不仅可以较好地脱去秘鲁鱿鱼吸盘环齿，还能在一定程度上保持环齿完整性，可在工业化生产中推广应用。

天然生物材料在形成过程中，经过长期的自然选择和进化，会形成与环境相适应的独特的结构和组成[28-29]。本研究对秘鲁鱿鱼吸盘环齿的主要成分进行测定，发现其主要成分为蛋白质，蛋白含量高达86.75%，同时采用红外光谱对其进行分析，分析结果显示鱿鱼吸盘环齿具有蛋白质的吸收峰，但不具有甲壳素的吸收峰，与基本成分测定的结果相吻合。秘鲁鱿鱼吸盘环齿的微观结构观察显示其具有多孔结构，这与很多天然材料如木材、珊瑚和植物茎的结构相一致，其密集的孔隙会使吸盘环齿形成特定的高弯曲刚度[30]，同时多孔结构会降低吸盘环齿的密度，增强其结构稳定性。

目前，很多天然材料的应用范围已扩散至热塑性高分子领域，但大多天然材料本身热塑性较差，需要经过与增塑剂混合或进行化学改性，才能具有热塑性[31-32]。张鲁燕等[33]报道了热塑性接枝改性羽毛角蛋白膜材的制备，天然羽毛角蛋白未出现熔融峰，热塑性较差，经过接枝改性后出现了熔融峰，熔点为130℃。本研究采用差示热量扫描法对秘鲁鱿鱼吸盘环齿的热稳定性进行分析，发现鱿鱼吸盘环齿在118.6℃时出现熔融峰，说明其具有良好的热塑性，熔点为118.6℃。与张鲁燕等[33]的结果比较，秘鲁鱿鱼吸盘环齿的熔点较改性羽毛角蛋白低，其热塑性更加突出。综合上述分析的结构特点认为，秘鲁鱿鱼吸盘环齿可作为一种天然生物材料，具有良好的潜在开发应用前景。

4 结论

本研究首次采用酶解法对秘鲁鱿鱼吸盘环齿进行脱环齿试验，确定木瓜蛋白酶为最优蛋白酶，并利用响应面法优化得到最佳酶解脱齿工艺条件：酶添加量 1 700 U·g-1、酶解温度43℃、酶解时间34 min，此条件下得到的秘鲁鱿鱼吸盘环齿脱齿率为96.2%。将得到的鱿鱼吸盘环齿进行组成结构及特性分析，结果表明，秘鲁鱿鱼吸盘环齿主要成分为蛋白质，不含有甲壳素，其微观结构为平行管状模块构成的多孔结构，具有一定的热塑性和耐酸碱性。本研究结果为秘鲁鱿鱼吸盘环齿酶法脱离工艺提供了理论依据，对鱿鱼吸盘环齿的综合利用有一定的积极意义。