福建漳浦野生稻稻瘟病抗性鉴定评价和抗性基因检测

江 川 朱业宝 张 丹 陈立喆 王金英

(福建农业科学院水稻研究所，福建 福州 350018)

稻瘟病(Magnaporthegrisea)是由子囊菌(Magnaportheoryzae)引起的世界水稻生产中最具毁灭性病害之一。据统计，全球每年因稻瘟病造成的水稻产量损失为10%～50%，每年经济损失超过700亿美元[1]。我国几乎所有水稻栽培地区都有稻瘟病害的发生，稻瘟病对我国水稻造成的减产平均每年约44.6万t[2]，尤其是南方稻区的高温高湿气候，有利于水稻稻瘟病的流行，多次出现稻瘟病大面积暴发事件，严重危害我国粮食生产安全[3]。实践证明,培育和推广抗稻瘟病品种是控制稻瘟病最经济、有效和环保的措施[4]。但稻瘟病菌生理小种繁多且高度变异，大多数抗病品种连续种植几年后就会因田间稻瘟病菌群体结构发生变化而丧失抗性[5-6]。因此，抗稻瘟病品种的选育必须依赖新的抗性资源的发掘和利用。

近年来我国已从水稻种质资源中筛选和鉴定出一批优良的抗稻瘟病资源，并利用分子标记技术鉴定和定位出约100个稻瘟病抗性基因，其中有28个已被成功克隆[7-8]。Pikm、Pik、Pia、Pikh、Pita、Pib、Pita-2、Piz和Piz-t等稻瘟病抗性基因已作为特异性分子标记应用于水稻种质资源抗稻瘟病基因型的鉴定以及分子标记辅助抗病育种[9]。作为功能性标记基因，Pid2对我国稻瘟病生理小种ZB15表现较高的叶瘟抗性[10]，Pi9对13个国家的43个稻瘟病菌株均表现出较好的抗性[11]，Pi2对从我国收集的792个稻瘟病小种的绝大部分表现抗性[12]，Pi54(Pikh)属于CC-NBS-LRR家族的抗病基因，抗谱较广，Pi5对PO6-6、KJ105a等5个稻瘟病小种表现为抗病[13]，Pikm是由2个紧密连锁的具有独立功能NBS-LRR类基因Pikm1-TS与Pikm2-TS组成[14]，这些功能标记是基于与表型性状紧密相关的功能基因的内部多态性序列而开发的标记方法，可以高效地筛选自然群体及育种群体中的有利基因[15]。目前育种上研究和利用的稻瘟病抗源大部分来自栽培稻[16]。普通野生稻是栽培稻的近缘祖先，蕴含特有的有利基因，遗传多样性十分丰富，并且多样性大于栽培稻，具有抗旱性强、抗多种病害、米质优良等特点，是水稻稻瘟病抗性育种的又一重要资源，已得到育种工作者的广泛关注[17]。因此可以利用普通野生稻丰富有利的变异类型，不断挖掘、定位和克隆普通野生稻的稻瘟病抗性基因，为水稻稻瘟病抗性育种提供丰富的新抗源，结合分子标记辅助技术，加速培育抗病水稻新品种。

福建漳浦野生稻是分布于我国大陆最东纬度的唯一的普通野生稻。目前已完成漳浦野生稻农艺性状、耐冷性和部份材料的营养品质鉴定评价[18]。但关于福建漳浦普通野生稻稻瘟病抗性鉴定评价的研究尚未见报道。本研究在福建省上杭县茶地镇国家/省级水稻新品种抗性鉴定示范基地对福建漳浦普通野生稻资源进行苗瘟、叶瘟和穗瘟的抗性鉴定评价，并利用Pi9、Pid2、Pi5、Pi2、Pi54和Pikm共6个常用的抗性基因的功能标记检测67份材料的稻瘟病抗性基因型，旨在筛选出优异的稻瘟病抗性材料用于抗性基因挖掘和品种改良，为稻瘟病抗性基因研究和育种利用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料来源于种植在福建省农业科学院水稻研究所网室中的67份福建漳浦普通野生稻(表1)。

1.2 方法

1.2.1 田间自然诱发鉴定 田间自然诱发鉴定圃设在福建省上杭县茶地镇国家/省级水稻新品种抗性鉴定示范基地，该地雨量集中，空气湿度较大，年平均气温20.1℃，日照时间短，是水稻稻瘟病的常发区和重发区。供试的67份材料于2016年6月10日播种，每份材料播100粒种子，7月15日移栽，株行距为16.7 cm×16.7 cm， 7月10-13日调查苗瘟发病情况，8月25-27日调查叶瘟发病情况，10月13-23日调查穗瘟发病情况，田间管理按照常规大田进行，并在水稻整个生育期保持适当水层，增施氮肥。2017年鉴定对象为2016年鉴定结果苗瘟、叶瘟或穗瘟病级达中抗(3级)以上的15份材料，鉴定时期同2016年，并取2年中病级高的数据为最终稻瘟病抗性级别。设置感病对照品种为丽江新团黑谷，抗病对照品种为特特普。苗瘟、叶瘟和穗瘟调查参照NY/T 2646-2014[19]。

表1 67份漳浦野生稻Table 1 67 Zhangpu wild rices

1.2.2 抗性基因的分子检测 分蘖盛期取叶片，并采用SDS抽提法[20](稍作改进)进行DNA提取。分别合成能够扩增Pi9、Pid2、Pi5、Pi2、Pi54和Pikm6个基因的引物序列，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，抗病基因Pikm由2个引物共同决定，其中Ckm1和Ckm2均出现抗病条带为含抗性基因(表2)；PCR的扩增反应体系总体积为10 μL，包括基因组DNA 1 μL，10×Taq Buffer 1μL，2.5 mmol·L-1dNTP 0.2 μL，上下游引物各0.4 μL，Taq聚合酶0.1 μL，ddH2O补足至 10 μL。PCR扩增反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，退火30 s(检测Pi9、Pi5、Pi2和Pi54标记引物的退火温度均为55℃、检测Pid2标记引物的退火温度为58℃、检测Pikm标记引物退火温度为60℃)，72℃延伸30 s，35个循环；72℃终延伸5 min，待温度降至16℃时取出，置于4℃冰箱保存备用。PCR产物加3 μL 5×Loadding Buffer混匀，用5%非变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳，结束后用加核酸染料染色，并在Ultra-Lum凝胶成像系统(美国)拍照读带。

表2 稻瘟病基因分子标记检测引物信息Table 2 Marker detecting primers for rice blast gene

1.3 数据统计与分析

利用Microsoft Excel 2007和SPSS 13.0软件对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 漳浦野生稻对稻瘟病的抗性表现

由图1可知，67份材料中高抗(high resistance，HR)0份；抗(resistance，R)0份；中抗(moderate resistance，MR)3份，占4.48%；中感(middle sense，MS)33份，占49.25%；感(sense，S)15份，占22.39%；高感(high sense，HS)16份，占23.88%。抗稻瘟病材料3份，占4.48%，感病材料64份，占95.52%。感病对照品种广二矮和丽江新团黑均表现高感(9级)，抗病对照品种特特普表现抗病(1级)。由此可见，漳浦野生稻稻瘟病抗性材料所占的比例较少，普遍不抗稻瘟病。

图1 67份漳浦野生稻抗稻瘟病综合评价Fig.1 Rice blast resistance grade of comprehensive assessment for 67 germplasms

2.2 不同时期的稻瘟病抗性表现及相关性分析

由表3可知，3个不同生育期均鉴定出抗(0～2级)和中抗(3级)野生稻材料，苗期抗(0～2级)和中抗(3级)材料分别是4份和1份；分糵期抗(0～2级)和中抗(3级)材料分别是7份和2份；成熟期抗(0～2级)和中抗(3级)材料分别是3份和5份。在苗瘟鉴定时仅有5份(7.46%)为抗病材料，62份(92.54%)为感病材料；叶瘟鉴定时有9份(13.43%)为抗病材料，58份(86.57%)为感病材料；穗瘟鉴定时有8份(11.94%)为抗病材料，59份(88.06%)为感病材料。3个时期野生稻各材料间病情差异明显，变异系数在31.65%～43.46%之间。

通过3个时期病情指数相关分析表明，苗瘟和叶瘟呈极显著正相关，相关系数为0.82，穗瘟和苗瘟、叶瘟呈极显著正相关，相关系数分别为0.33和0.41。

表3 漳浦野生稻苗期、分糵期和成熟期期抗稻瘟病表现Table 3 Phenotype of rice blast resistance in seedling stage, tillering stage, and maturing stage of Zhangpu wild rice

2.3 漳浦野生稻2个自然居群稻瘟病抗性比较

漳浦野生稻群体M1来源于距离湖西畲族乡赵家堡村约100 m的石湖潭。群体M2来源于在湖西畲族乡岭脚自然村的古塘。2个群体不同时期各材料稻瘟病病级差异明显，变异系数介于28.30%～45.60%之间，3个时期中分糵期变异系数最大，石湖潭和古塘变异系数分别为41.28%和45.60%(表4)。从病级的平均值来看，苗期抗性比分糵期和成熟期抗性差。2个自然居群的苗瘟、叶瘟和穗瘟抗性差异均不显著(表5)。

表4 2个居群稻瘟病抗性表现Table 4 Phenotype of rice blast resistance in 2 natural populations

2.4 6个抗性基因的分子标记检测结果

利用Pi9、Pid2、Pi5、Pi2、Pi54和Pikm共6个抗性基因的分子标记基因检测67份野生稻稻瘟病抗性基因型。由图2可知，较多杂合基因，如Pi5位点和Pi9位点均有4份材料扩增出杂合带型，Pi54位点有22份材料扩增出杂合带型，Pikm2个位点分别有38份和16份材料扩增出杂合带型，说明漳浦野生稻杂合度较高。用Pi54分子标记检测有23份材料(M1033、M1036、M1038、M1045、M1047、M1049、M1051、M1054、M2002、M2005、M2011、M2013、M2016、M2017、M2027、M2034、M2036、M2037、M2038、M2039、M2040、M2041和M2043)出现216 bp抗病的特征条带；用Pi5分子标记检测有17份材料(M1018、M1019、M1020、M1022、M1047、M1049、M1051、M1055、M2001、M2006、M2007、M2009、M2011、M2012、M2014、M2022和M2024)出现 206 bp 抗病的特征条带；用Pi9分子标记检测有4份材料(M1002、M1018、M1033和M2009)出现219 bp抗病的特征条带；用Pikm分子标记检测有2份材料(M1018和M1027)出现174 bp和290 bp抗病的特征条带；用Pi2分子标记检测所有材料都未出现450 bp抗病特征条带；用Pid2分子标记检测所有材料都未出现1009 bp和629 bp抗病特征条带。表明漳浦野生稻4份含有Pi9的抗性基因，17份含有Pi5的抗性基因，23份含有Pi54的抗性基因，2份含有Pikm的抗性基因，均不含Pi2、Pid2的抗性基因。

表5 2个居群稻瘟病病级的方差分析Table 5 Variance analysis for rice blast resistance grade in 2 natural populations

注：A: Pid2基因功能标记扩增产物；B: Pi2基因功能标记扩增产物；C: Pi5基因功能标记扩增产物；D: Pi54基因功能标记扩增产物；E: Pi9基因功能标记扩增产物；F和G:Pikm基因功能标记扩增产物；M： Marker(DM1500)；泳道1～67代表67份野生稻。Note: A: The PCR products of Pid2 functional molecular marker. B: The PCR products of Pi2 functional molecular marker.C: The PCR products of Pi5 functional molecular marker. D: The PCR products of Pi54 functional molecular marker.E: The PCR products of Pi9 functional molecular marker. F and G: The PCR products of Pikm functional molecular marker. M: DNA Marker(DM1500). Lanes 1-67 means 67 wild rice.图2 67份野生稻稻瘟病基因的功能分子标记扩增结果Fig.2 PCR amplification of rice blast resistance genesby functional molecular markersin 67 wild rice

2.5 野生稻材料的抗性与抗性基因数量的关系

由表6可知，67份漳浦野生稻材料含有的抗性基因总数在0～3个之间，有30份材料(44.78%)不含所检测的6个抗性基因；29份材料(43.28%)含1个抗性基因，7份材料(10.45%)含2个抗性基因，1份材料(1.49%)含3个抗性基因。经过2年稻瘟病抗性鉴定筛选出M1044、M2010和M2016共3份表现中抗(3级)的野生稻材料，其中M1044、和M2010不含任何检测的抗性基因，M2016含Pi54基因。2份含有Pikm抗性基因的材料病级为9级，4份含有Pi9广谱抗性基因的材料病级为7级或9级，17份含有Pi5抗性基因和22份含有Pi54抗性基因材料病级都在5级以上，M1018含有Pi5、Pi9和Pikm3个抗性基因病级为9级，说明Pi9、Pi5、Pi54和Pikm4个抗性基因在漳浦野生稻抗性表现上较弱，也未出现基因的累加效应，抗性未得到增强。

表6 67份野生稻材料分子标记检测结果和抗性综评Table 6 Marker detection and resistance grade of comprehensive assessment for 67 germplasms

表6(续)

注：“+”表示含抗性基因，“-”表示不含抗性基因。

Note: ‘+’indicated the gene was contained, ‘-’ indicated the gene was not contained.

3 讨论

本研究通过对67份漳浦野生稻2年的田间自然诱发鉴定试验表明，2016年鉴定出稻瘟病中抗以上材料8份，2017年重复鉴定得到中抗以上材料9份，但鉴定的抗性材料并不完全重复。潘大建等[25]对高州野生稻、韦燕萍等[26]对广西野生稻和梁斌等[27]对云南野生稻鉴定结果也有相似的结论，这可能与气候条件的变化和稻瘟病生理小种的变异有关，但准确的结论还有待更深入的研究。漳浦野生稻稻瘟病抗性差，中抗(3级)材料仅占4.48%，这与何月秋等[28]对东乡野生稻进行喷雾接种鉴定得出抗稻瘟病材料仅占总数的3.26%及李湘民等[29]对东乡野生稻异位圃材料采用混合菌株喷雾器喷雾接种鉴定得出中抗的材料占总数的4.05%的结论基本一致。经过2年的稻瘟病抗性综合评价得到M1044、M2010、M2016共3份稻瘟病中抗(3级)材料，可作为抗稻瘟病育种的亲本材料。

漳浦野生稻3个时期的稻瘟病抗性差异明显，苗期抗性最差，平均病级为感病(7级)，分糵期和成熟期为中感(5级)，其原因可能是苗期叶片较细嫩易感病菌。3个时期病级的相关性分析表明，苗瘟与叶瘟极显著正相关，穗颈瘟与苗瘟、叶瘟呈极显著正相关，说明苗期材料稻瘟病抗性强，分糵期能正常分糵生长，成熟期能正常抽穗结实，因此筛选苗瘟抗性材料对保证稻谷的质量和产量具有重要意义。此外，漳浦野生稻2个自然居群的野生稻3个不同时期的抗性差异不显著，2个自然居群都在漳浦县湖西畲族乡境内，相距不远，气候和环境基本相同，表明野生稻材料在2个居群中病情趋势具有较大程度的一致性。

范方军等[30]、汪文娟等[31]、李刚等[32]研究表明稻瘟病抗性基因的聚合能提高材料对稻瘟病的抗性。但本研究表明携带Pi54、Pi5、Pi9或Pikm抗性基因的材料中，不管携带单个或是多个基因，仅1份携带Pi54基因的材料表现中抗，其他材料均表现感病。在3份表现中抗的材料中，2份没有携带检测的6个基因，1份携带Pi54基因，这3份材料可能存在其他已知或未知的新基因，但有待更深入研究。通过稻瘟病抗性基因检测发现，不同位点存在较多的杂合基因型，表明漳浦野生稻杂合度较高，这与孙希平等[33]的研究结果一致。

4 结论

本研究通过对67份漳浦野生稻2年的田间自然诱发鉴定试验表明，漳浦野生稻稻瘟病抗性较差，2年的田间自然鉴定仅获得M1044、M2010和M2016 3份中抗材料，漳浦野生稻不含Pid2和Pi2抗性基因，含有Pi54、Pi9、Pikm和Pi5抗性基因，除M2016含有Pi54抗性基因材料表现为中抗，其余抗性基因在漳浦野生稻中无效。为获得更多优良的漳浦野生稻稻瘟病抗性资源必需扩大田间自然鉴定群体的数量并结合室内接菌鉴定，下一步研究应在基因检测方面选择其他的抗病基因分子标记继续鉴定M1044、M2010和M2016 3份中抗材料的基因型，找到对漳浦野生稻有影响的抗性基因。本研究结果为野生稻的基础研究和利用提供了一定理论参考。