胜红蓟精油复合微乳液体系构建及其对芦柑保鲜的影响

乔自鹏 李书明 王奇志

(华侨大学化工学院，福建 厦门 361021)

芦柑(CitrusreticulateBlanc Ponkan)属芸香科柑橘属植物，其果实硕大，肉质脆嫩，汁多化渣，但果实在采后、运输贮藏及货架期极易感染绿霉病和青霉病，导致其感染的腐败真菌菌种主要是意大利青霉(Penicilliumitalicum)和指状青霉(Penicilliumdigitatum)[1-2]。此外，扩展青霉(Penicilliumexpansum)也能导致青霉病发生，其侵染果实后分泌的展青霉素是一种神经性真菌毒素，不仅会对食用者造成潜在的危害[3]，而且还会严重影响农业经济效益。目前，芦柑市场所用的保鲜剂可以抑制绿霉和青霉病，但是化学保鲜剂不仅会危害人体健康而且会污染环境[4-5]；物理保鲜剂往往需投入一定的设备成本；生物保鲜技术受外界环境影响较大[6-7]。其中，植物精油作为一种极具潜力的天然杀菌剂，不仅能有效抑菌而且可以增强芦柑果实保鲜效果[8]，是化学保鲜剂的良好替代品[9]。胜红蓟(AgeratumconyzoidesL.)是一种外来入侵植物，属于区域性恶性杂草[10]，其入侵农田后会造成农作物减产，给生态环境和人体健康带来危害。研究表明，胜红蓟精油主要成分为氧萘烯类物质，如早熟素和石竹烯等，对多种真菌具有抑制作用[11-12]。宁蕾等[13]研究发现胜红蓟精油对香蕉炭疽病菌(GlorospriummusarumCookeetMass)和柿角斑病菌(CercosporakakiEll. et Ev.)抑菌率高达100%。

植物精油存在稳定性、溶解性较差，且长期放置易变质等缺点，很少直接提取利用[14-15]。而微乳液是一种由表面活性剂、助表面活性剂、油与水等组分在适当比例下组成的无色、透明(或半透明)低黏度的热力学稳定体系，分散液滴直径为5～100 nm，是难溶性挥发精油的良好载体，可通过选择合适的表面活性剂和助表面活性剂构建微乳液体系，将精油很好地增溶到微乳体系中，从而提高其溶解性和稳定性[16-17]。因此，本研究选取胜红蓟精油作为油相，天然环保无毒的抑菌活性物质碳酸钠和羧甲基壳聚糖的水溶液为水相，乙醇为表面活性剂，吐温-80为助表面活性剂，构建复合微乳液体系，并研究其对芦柑的保鲜效果，以期为开发植物源芦柑保鲜剂提供数据来源，为胜红蓟等入侵植物的资源化利用提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

2017年11月-2018年1月，采摘福建永春果园中福建芦柑作为试验材料。挑选成熟度一致、无病虫害、无机械损伤、直径为65～75 mm的果实。供试菌种为意大利青霉(P.italicum)、指状青霉(P.digitatum)和扩展青霉(P.expansum)，由华中农业大学和中国农业科学院柑橘研究所提供。

孢子悬浮液的制备：用无菌水将培养在马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar，PDA)培养基斜面上的意大利青霉、扩展青霉和指状青霉孢子分别洗下，用血球计数板将孢子浓度用无菌水调整到106CFU·mL-1，得孢子悬浮液。再将各孢子悬浮液取等量的体积混合均匀，即得混合菌孢子悬浮液。

吐温-80(汕头市西陇化工有限公司)、碳酸钠(西陇化工股份有限公司)、无水乙醇(国药集团化学有限公司)、次氯酸钠(西陇科学股份有限公司)均为分析纯；羧甲基壳聚糖购自浙江澳兴生物科技有限公司；咪鲜胺购自黑龙江省佳木斯黑龙农药化工股份有限公司；马铃薯葡萄糖琼脂培养基购自广东环凯微生物有限公司。

1.2 胜红蓟精油复合微乳液的制备

采用超声波辅助水蒸气蒸馏法提取胜红蓟精油，工艺条件：超声功率120W、超声时间30 min、料液比1∶20 和粉末粒度40目。按照不同质量比(1∶1、1∶2和1∶3)将胜红蓟精油与无水乙醇混合均匀作为油相，添加不同浓度的碳酸钠、羧甲基壳聚糖作为水相，油相与表面活性剂吐温-80按不同的质量比(10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9 和0∶10)混合均匀，向上述混合溶液中逐渐加入水相，观察体系的状态变化。当体系由澄清变为浑浊，或由浑浊变为澄清状态时，记录变化时的临界加水相量，采用 Origin 9.0 软件绘制拟三元相图——多相区(体系呈乳白色浑浊态)、单相区(即微乳液，呈均匀透明状)及液晶区(呈半凝固均一状)。在拟三元相图中利用单相区面积(AT)来评价各成分的增溶能力，用动态激光粒度分析仪测定溶液粒径，筛选最佳微乳液体系配方。

1.3 复合微乳液对芦柑保鲜效果的测定

1.3.1 对3种致病菌的抑菌活性测定 将复合微乳液用无菌水溶解，取1 mL溶解液与19 mL已冷却至40～55℃灭菌的PDA培养基充分混匀，使其最终浓度分别达到1.25、2.5、5、10、20 mg·mL-1，以加入无菌水培养基作为对照。用无菌打孔器在培养5 d的病原菌(意大利青霉、指状青霉和扩展青霉)的平板上取直径6 mm的菌饼，转移到所有平板中央，于28℃生化培养箱培养，接种后分别于培养5 d后测定该菌生长的直径。每个处理设3个平板，试验重复3次。在常温(25℃)条件下进行上述操作。按照公式计算菌丝生长抑制率：

(1)

式中，dc为对照组菌落生长直径；dt为试验组菌落生长直径；di为菌饼直径。

1.3.2 对芦柑的抑菌活性测定 参照周梦娇[18]的方法。在无菌条件下，于超净工作台中先将芦柑果实进行伤口处理，在果实腰部用小刀刺伤一个直径为4 mm、深度为3 mm的圆形伤口，在伤口处接种20 μL混合菌孢子悬浮液，再接种50 μL浓度分别为2.5、5.0、10.0、20.0 mg·mL-1的复合微乳液，接种完成后将芦柑果实放置于灭菌的托盘中，用保鲜膜封口，对照组接种等量的无菌蒸馏水与混合菌孢子悬浮液。处理完成后将托盘于28℃培养箱培养5 d，用游标卡尺，采用十字交叉法测量果实表面病菌生长的直径，每组6个芦柑果实，试验重复3次。操作条件同1.3.1。按照公式计算抑菌率：

(2)

式中，dc为对照组病菌生长直径；dt为试验组病菌生长直径。

1.3.3 芦柑失重率和腐烂率的测定 采摘的芦柑果实用清水清洗后采用 2%次氯酸钠溶液浸泡2 min，然后再次用清水冲洗，自然条件晾干。将晾干的芦柑随机分成复合微乳液处理组、咪鲜胺处理组和空白对照组(control，CK)3组，每组50个芦柑果实。其中，复合微乳液处理：将芦柑果实表面浸泡在 20 mg·mL-1复合微乳液中 2 min，自然晾干；咪鲜胺处理：将芦柑果实表面浸泡在20 mg·mL-1咪鲜胺中2 min，自然晾干；CK：不作任何处理。芦柑果实处理后装入聚乙烯塑料薄膜袋，一批于常温25℃贮藏，另一批于4℃冷藏，两批均在相对湿度为85%下保存。定期检测芦柑果实腐烂情况和失重情况，重复处理3次。按照公式计算芦柑失重率和腐烂率：

(3)

式中，Mo为芦柑保鲜前的重量；Mt为芦柑保鲜期间每隔一定时间的重量。

腐烂率=腐烂个数/总果数×100%

(4)。

1.4 数据处理

试验结果均以3次重复试验的平均值±标准偏差表示。数据统计分析采用 SPSS 22.0 软件进行，并运用Duncan’s 检验法进行多重比较和差异显著性分析(P< 0.05)。采用Origin 9.0 软件制图。

2 结果与分析

2.1 复合微乳液体系的构建

本研究选用吐温-80作为表面活性剂，以乙醇为助表面活性剂，以碳酸钠和羧甲基壳聚糖为水相，利用拟三元相图确定最终的微乳液体系，结果见图1。加入不同比例的乙醇考察其对微乳体系相行为的影响(图1-A)。当胜红蓟精油与乙醇的质量比为1∶1, 形成的单相区面积AT为66.04%；随着胜红蓟精油与乙醇的质量比提高到1∶3，微乳液体系单相区面积增加至85.59%，故选择胜红蓟精油与乙醇的质量比为1∶3进行后续试验。加入不同浓度的碳酸钠考察其对微乳体系相行为的影响(图1-B)。3%碳酸钠溶液形成最大的单相区面积AT为93.22%，而5%碳酸钠溶液形成的单相区面积AT下降至59.35%，故选择3%碳酸钠进行后续试验。加入不同浓度的羧甲基壳聚糖考察其对微乳体系相行为的影响(图1-C)。随着羧甲基壳聚糖溶液浓度增加，形成的微乳液单相区面积 AT逐渐减小，由84.63%下降至14.99%，故确定0.5%羧甲基壳聚糖进行后续试验。

不同比例的3%碳酸钠和0.5%羧甲基壳聚糖溶液作为水相对微乳体系相行为的影响(图1-D)。3%碳酸钠和0.5%羧甲基壳聚糖比例为1∶3时，能形成较大的单相区，且当油相与吐温-80的比例为1∶1 时，存在无限稀释线，而3%碳酸钠和0.5%羧甲基壳聚糖比例为1∶1和3∶1 时，形成的单相区面积减少，故选择3%碳酸钠和0.5%羧甲基壳聚糖比例为1∶3时的相图作为最终的复合微乳液体系。

2.2 复合微乳液配方的优化

在三相图内，空白区域为单相区，即为微乳液区。在微乳液区域选取无限稀释线，即稀释线上对应的点表示的各组分在此比例下均能形成微乳液。针对筛选出的复合微乳液相图(图2)，选取最高的一条无限稀释线，即L55。此时，精油∶乙醇=1∶3作为油相，油相∶吐温-80=1∶1，3%碳酸钠∶0.5%的羧甲基壳聚糖=1∶3作为水相，测定这条稀释通道上随着水相的增加其纳米粒径的变化情况。由表1可知，A60、A70、A80和A90体系微乳液粒径分别为59.68、51.28、34.47、91.81 nm，均小于100 nm，符合微乳液粒径在1～100 nm之间的定义。A80体系的多分散系数(polymer dispersity index，PDI)值为0.530，说明胜红蓟精油、吐温-80、乙醇、碳酸钠和羧甲基壳聚糖等成分形成的微乳液体系分散性好。因此，选取A80体系的微乳液进行后续研究。

2.3 复合微乳液对3种致病菌的抑菌活性测定

由图3可知，复合微乳液A80对扩展青霉的抑制活性高于意大利青霉和指状青霉，不同浓度复合微乳液A80对意大利青霉、扩展青霉和指状青霉抑菌效果差异显著(P<0.05)。随着复合微乳液A80浓度的增大,其对意大利青霉、指状青霉和扩展青霉的抑制率逐渐增强，当复合微乳液A80浓度增加至20 mg·mL-1时，其对意大利青霉、指状青霉和扩展青霉的抑制率分别为64.86%、60.23%和86.96%。

2.4 复合微乳液对芦柑的抑菌活性测定

由表2可知，复合微乳液浓度与芦柑青霉活体防治效果呈正相关，随着复合微乳液浓度的增加，复合微乳液对芦柑青霉病的病斑扩展抑制作用逐渐增强，且不同浓度处理组的抑菌效果差异显著(P<0.05)。当复合微乳液浓度为20 mg·mL-1时，抑菌效果最好，抑制率达到76.48%。

2.5 复合微乳液A80对芦柑的保鲜效果

2.5.1 常温和冷藏条件下复合微乳液A80对芦柑失重率的影响 由表3可知，随着贮藏时间的延长，不同贮藏温度下各处理组芦柑果实的失重率均逐渐升高。相同贮藏温度下，复合微乳液A80处理组、咪鲜胺处理组和空白对照组中芦柑果实失重率差异均显著(P<0.05)，且复合微乳液A80处理组、咪鲜胺处理组中芦柑失重率均显著低于空白对照组(P<0.05)；冷藏条件下各处理组芦柑失重率显著低于常温条件(P<0.05)，冷藏(4℃)30 d时，芦柑果实失水情况较为严重，复合微乳液A80处理组、咪鲜胺处理组和空白对照组芦柑失重率分别为22.24%、12.67%和26.47%，但均显著低于同期常温贮藏(25℃)。综上，复合微乳液A80结合冷藏处理可以降低采后芦柑的重量变化，在一定程度上能减缓芦柑水分的损失，延缓芦柑腐烂的速度。

注：A：不同比例的乙醇对微乳体系相行为的影响；B：不同浓度碳酸钠对微乳体系相行为的影响；C：不同浓度羧甲基壳聚糖对微乳体系相行为 的影响；D：不同比例的3%碳酸钠和0.5%羧甲基壳聚糖作为水相对微乳体系相行为的影响。Note: A: Effects of different proportions of ethanol on the phase behavior of microemulsion system. B: Effects of different concentrations of sodium carbonate on the phase behavior of microemulsion system. C: Effects of different concentrations of carboxymethyl chitosan on the phase behavior of microemulsion system. D: Effects of different proportions of 3% sodium carbonate + 0.5% carboxymethyl chitosan (as the aqueous phase) on the phase behavior of microemulsion system. 图1 微乳液体系的构建Fig.1 Construction of micro-emulsion system

水相占比Water phase proportion/%组成Composition粒径Partical size/nm多分散系数PDI0(A0)精油∶乙醇∶吐温-80=1∶3∶41 8721.00010(A10)精油∶乙醇∶吐温-80∶3%碳酸钠∶0.5%羧甲基壳聚糖=4.5∶13.5∶18∶1∶31 7791.00020(A20)精油∶乙醇∶吐温-80∶3%碳酸钠∶0.5%羧甲基壳聚糖=2∶6∶8∶1∶32 1561.00030(A30)精油∶乙醇∶吐温-80∶3%碳酸钠∶0.5%羧甲基壳聚糖=1∶3.5∶4.67∶1∶34 2321.00040(A40)精油∶乙醇∶吐温-80∶3%碳酸钠∶0.5%羧甲基壳聚糖=0.75∶2.25∶3∶1∶32 5861.00050(A50)精油∶乙醇∶吐温-80∶3%碳酸钠∶0.5%羧甲基壳聚糖=0.5∶1.5∶2∶1∶3254.20.89760(A60)精油∶乙醇∶吐温-80∶3%碳酸钠∶0.5%羧甲基壳聚糖=0.33∶1∶1.33∶1∶359.681.00070(A70)精油∶乙醇∶吐温-80∶3%碳酸钠∶0.5%羧甲基壳聚糖=0.21∶0.64∶0.86∶1∶351.280.74780(A80)精油∶乙醇∶吐温-80∶3%碳酸钠∶0.5%羧甲基壳聚糖=0.13∶0.38∶0.13∶1∶334.470.53090(A90)精油∶乙醇∶吐温-80∶3%碳酸钠∶0.5%羧甲基壳聚糖=0.06∶0.17∶0.22∶1∶391.810.693

注：字母A下的数字表示复合微乳液系统中水相(3%碳酸钠：0.5%羧甲基壳聚糖=1∶3溶液)所占的质量百分比。

Note: The number under the letter A represents the percentage of the mass of the water phase(3% sodium carbonate: 0.5% carboxymethyl chitosan=1∶3 solution) in the composite micro-emulsion system.

图2 复合微乳液配方的优化Fig.2 Optimization formulation of compound micro-emulsion

注：不同小写字母表示不同浓度复合微乳液对相同致病菌抑菌结果差异显著(P<0.05)。Note：Different lowercase letters indicate significant differences in the inhibition results against same pathogens by the different concentrations of compound micro-emulsion (P< 0.05).图3 复合微乳液A80对意大利青霉、指状青霉和扩展青霉菌丝生长的影响Fig.3 Effects of compound micro-emulsion A80 on mycelium growth of P. italicum, P. digitatum and P. expansum

复合微乳液浓度Compound micro-emulsion concentration/(mg·mL-1)病菌直径Diameter of germs/mm抑菌率Antibacterial effect/%0(CK)42.74±0.66a-2.538.62±0.66b9.63±1.55a530.15±1.14c29.45±2.68b1019.23±0.66d55.00±1.54c2010.05±0.81e76.48±1.90d

注：“-”表示无显著抑菌作用；同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

Note: ‘-’ indicates no significant differences in the antimicrobial action, while different lowercase letters in the same columns indicate significant differences (P< 0.05).

2.5.2 常温和冷藏条件下复合微乳液A80对芦柑腐烂率的影响 水果的腐烂率是直观体现保鲜效果的重要指标。由表4可知，相同贮藏温度下，与空白对照组相比，复合微乳液A80处理组和咪鲜胺处理组的芦柑果实腐烂率均显著降低(P<0.05)；冷藏(4℃)条件下各处理组芦柑失重率均低于常温(25℃)条件，冷藏(4℃)30 d时，芦柑果实腐烂情况较为严重，复合微乳液A80处理组、咪鲜胺处理组和空白对照组芦柑腐烂率率分别为11.33%、6.67%和22.00%(P<0.05)，且均显著低于常温贮藏(25℃)。综上，复合微乳液在一定程度上可以降低芦柑的腐烂率，具有一定的防腐效果。

表3 25℃和4℃条件下复合微乳液A80对芦柑失重率的影响

Table 3 Effect of compound micro-emulsion A80on weight loss ofC.reticulateBlanc Ponkan at storage at 25℃ and 4℃ /%

贮藏温度Storage temperature/℃处理Treatments贮藏时间Storage time/d5101520253025复合微乳液A80处理组7.9±0.66Aa12.86±0.99Aa15.47±1.45Aa21.24±0.66Aa25.93±1.62Aa32.31±0.58Aa咪鲜胺处理组2.35±0.20Ab5.01±0.49Ab7.26±0.28Ab11.37±0.46Ab13.88±0.31Ab17.54±0.58Ab空白对照组11.30±0.86Ac16.67±0.36Ac20.70±0.74Ac26.21±0.79Ac32.44±0.88Ac40.66±0.68Ac4复合微乳液A80处理组5.96±0.26Ba8.15±0.05Ba11.68±0.66Ba16.06±0.66Ba17.69±0.35Ba22.24±0.93Ba咪鲜胺处理组1.68±0.17Bb3.71±0.23Bb5.70±0.61Bb8.62±0.72Bb10.62±0.32Bb12.67±0.67Bb空白对照组8.67±0.41Bc12.05±0.56Bc14.60±0.46Bc19.28±0.46Bc22.23±1.07Bc26.47±0.99Bc

注：同列不同大写字母表示相同处理组不同贮藏温度下芦柑失重率差异显著(P<0.05)；同列不同小写字母表示相同贮藏温度不同处理组间芦柑失重率差异显著(P<0.05)。下同。

Note: Different uppercase letters in the same columns indicate significant differences in the weight loss rate ofC.reticulateBlanc Ponkan is at different storage temperatures between the same treatment groups (P<0.05). Different lowercase letters in the same columns indicate significant differences in the weight loss rate ofC.reticulateBlanc Ponkan is at the same storage temperature between various treatment groups (P< 0.05). The same as following.

表4 25℃和4℃条件下复合微乳液A80对芦柑腐烂率的影响 Table 4 Effect of compound micro-emulsion A80 on decay rate of C. reticulate Blanc Ponkan at storage 25℃ and 4℃ /%

3 讨论

复合微乳液A80能有效抑制意大利青霉、指状青霉和扩展青霉的生长，20 mg·mL-1复合微乳液A80与冷藏(4℃)保鲜结合能有效降低贮藏期间芦柑果实的失重率和腐烂率，这与Raid等[19]利用橘皮精油微乳液延长鲜切橙的货架期效果相似。其主要原因可能是胜红蓟精油作为植物天然抑菌物质[20-21]，含有一些生物活性成分，如挥发性的单萜、倍半萜和柠檬苦素、类黄酮等，这些活性成分具有抑菌作用[22-23]。且加入的乙醇、3%碳酸钠溶液及0.5%羧甲基壳聚糖，使得本研究构建的复合微乳液增溶能力增强，延长了对芦柑的保鲜效果。同时，精油与乙醇的质量比为1∶3时，有较好的增溶效果，说明加入短链醇乙醇能明显降低界面膜的弯曲系数，一定范围内，随着乙醇浓度的增加，微乳液的增溶能力增强，这与Chen等[24]的研究结论一致。选取3%碳酸钠作为水相，是因为一定浓度的盐溶液能提高表面活性剂的亲水性能，但是过高浓度的盐溶液会导致非离子型表面活性剂(吐温-80)产生盐析作用，盐析作用聚集到一定程度后会造成微乳液体系产生浑浊，形成多相区，这也验证了前人的研究结论[25-26]。选取0.5%羧甲基壳聚糖作为水相是由于高浓度羧甲基壳聚糖分子间存在极强的氢键作用而相互缠绕，使得能进入界面膜的羧甲基壳聚糖分子减少，会造成增溶能力减弱[27-28]。

复合微乳液体系A80配方的粒径及PDI优于詹少颖等[29]用蜜桔皮精油构建的微乳液体系，不仅降低了精油成本，而且提高了胜红蓟精油在碳酸钠和羧甲基壳聚糖水相中的的溶解度，利于喷施。为了使本试验构建的复合微乳液应用于芦柑果实保鲜，需进一步深入研究其对芦柑果实其他品质指标的影响。

4 结论

本研究构建的复合微乳液体系提高了胜红蓟精油在水中的溶解度，并且该微乳液应用于芦柑果实的采后保鲜，可以减缓芦柑的水分散失，抑制水果表面有害病菌的生长，提高芦柑的贮藏品质。胜红蓟是常见的入侵杂草，利于采集，因此，开发胜红蓟精油微乳液应用于芦柑保鲜具有资源优势。