高通量基因测序技术在胎儿性染色体非整倍体检测中的应用

蔡海英 许华英 熊卿圆

染色体非整倍体异常是最为严重的出生缺陷之一, 最为常见的为13三体综合征、18三体综合征、21三体综合征以及性染色体异常, 以上为智力障碍以及生理缺陷的重要指征,目前尚无任何有效治疗方法［1］。当下, 主要通过产前筛查来检查高危人群, 为此无创产前筛查应运而生, 而NIPT-plus对13三体综合征、18三体综合征、21三体综合征的检查中具有高通量、错误率低的优势, 已经被临床上广泛应用。然而,该技术在性染色体异常中的研究非常少, 对于其可行性作者将进行研究, 为在日后工作中积累经验, 现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2018年7月～2019年1月到佛山市禅城区中心医院门诊产检的200例单活胎孕妇作为研究对象,经医院伦理学委员会审批同意, 签署知情同意书。

1.2 纳入标准 所有参加 NIPT-plus筛查的夫妻双方不是染色体非整倍体疾病患者、染色体多态表现且近期未接受过异体输血、移植手术、干细胞治疗、免疫治疗等。

1.3 方法

1.3.1 样本的采集、保存、运输 采集孕妇7～10 ml外周血(采血手法与一般采血无异), Ardent抗凝管采集完毕后轻微颠倒采血管10次, 常温15～30℃暂存, 72 h内送达并及时分离血浆。血浆样本应在干冰条件下运输, 到达后及时存放于-80℃冰箱中。

1.3.2 游离DNA提取 使用磁珠法在200～600 μl血浆提取游离 DNA。游离DNA提取是将游离DNA从血浆细胞中裂解,分离, 纯化提取的过程。并建立标准的质量控制体系。保证游离DNA的质量达到下步实验要求, 保证其片段多态性有足够的代表性。

1.3.3 文库制备 文库的制备是将提取好的DNA进行末端修复、补平, 加测序接头、扩增及纯化的过程, 其目的是为之后的测序制作好合格的文库DNA。对于同一个run的不同文库可使用特异性接头(barcode)进行区分。同一个run里面不能出现2个相同的barcode。文库的构建严格按照标准流程进行, 建库后的DNA浓度应＞0.2 ng/ml, 且片段长度达到目标片段长度范围［胎儿游离DNA(cffDNA)一般在150～200 bp］［2］。

1.3.4 测序及数据分析 DNA测序是指经过一系列检测分析特定DNA片段的碱基序列的过程。DNA数据分析是指将测序仪生成的原始的read比对到一个参考序列对比, 并将对比上的read进行可视化及得出相关生物学意义的过程。研究表明, 胎儿基因组符合正态分布规律。在基因分析领域,常用正态分布的理论来推断差异发生率, 从而判断个体是否存在显著的差异。临床试验中采用大数据做成正态分布图,判断标准为Z值。在无创产前检测中,Z值介于-3～3, 一般判断为阴性, 反正为阳性［3-6］。

1.3.5 阴阳性质控 为了更好的保证检测的准确性, 防止因机器故障等导致检测样品出现假阴性和假阳性的发生, 在每次检测中应该加入至少一对的阴阳性质控, 用于监控测序结果是否真实有效［7,8］。阴阳性质控品应是已确定知道其准确结果的DNA片段。所需浓度及测序方法与一般样品无异。

1.3.6 羊水染色体核型分析 对无创产前基因测序提示性染色体非整倍体综合征高风险孕妇, 经产前遗传咨询、知情同意后, 在手术室, 无菌操作下, 超声引导定位, 经腹羊膜腔穿刺抽取羊水 20 ml, 送遗传实验室进行羊水细胞培养、得到分裂中期的细胞, 再经过氯化钾溶液低渗、固定液固定、滴片制成玻片、胰酶消化、吉姆萨染色一系列实验操作, 在油镜下观察分裂相的染色体形态, 根据国际人类细胞遗传学命名体系(ISCN2013)进行核型分析及计数［4,9］。

2 结果

2.1 NIPT-plus与羊水细胞核型结果分析 200例样本中,NIPT-plus提示3例性染色体非整倍体存在异常, 其中1例(45,X), 1例(47, XXX), 1例(47, XXY)。经羊水细胞培养G显带染色体核型, 其中2例与NIPT-plus结果一致, 而1例羊水染色体核型分析结果为正常核型。见表1。

表1 NIPT-plus与羊水细胞核型结果

2.2 NIPT-plus准确性分析 200例样本中NIPT-plus筛查出3例染色体非整倍体异常, 检出率为1.5%(3/200)；经羊水染色体核型确诊2例染色体非整倍体异常, 染色体非整倍体异常发生率为1.0%(2/200), NIPT-plus筛查的阳性预测值为66.67%(2/3)。

3 讨论

高龄产妇的卵子老化, 导致在减数分裂时存在染色体不分离的情况增高, 影响增加胎儿染色体异常, 性染色体异常与孕妇的年龄具有相关性［10］。NIPT-plus对染色体非整倍体异常检测的阳性预测值高达66.67%, 此外1例假阳性结果的出现与母体因素、性染色体互换以及胎盘滋养层细胞有一定的关联。结果较参考文献中的数据存在差距, 这与个体化差异等多方面因素有一定的关系, 仍需在增加研究样本的同时,深入研究为临床提供更加科学的依据。

综上所述, NIPT-plus技术应用于胎儿性染色体非整倍体检测中具有一定的可行性, 可以作为临床辅助检查的手段之一。