高效液相色谱法测定蔬菜和水果中15种欧盟优控多环芳烃

王钟，何漪，王敏，邢燕，殷茂荣

（淄博市疾病预防控制中心，山东淄博255026）

多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是非常重要的一类持久性有机污染物（persistent organic pollutants，POPs），广泛存在于自然界中。多环芳烃是由2个或2个以上的苯环以稠环或非稠环的形式相链接的性能稳定的化合物，其中大部分化合物具有较强的致癌特性[1]。随着所含苯环数的增加，多环芳烃的致癌特性明显增强。目前关于多环芳烃的研究主要集中于美国环保署（U.S Environmental Protection A－gency，EPA）提出的16种优先控制多环芳烃，而对于欧洲食品安全局2008年提出的15种欧盟优控多环芳烃（European priority controlled polycyclic aromatic hydrocarbons，EU-PAHs）的报道较少。欧盟优控多环芳烃中包括8种EPA优控PAHs及其他8种新物质，EU优控新增了更多重质多环芳烃，剔除了EPA优控中的轻质多环芳烃。目前，对于水[3]和土壤[4]中多环芳烃的研究较多，而鲜有对于蔬菜和水果中欧盟优控多环芳烃的研究。截至目前，我国尚未建立检测蔬菜和水果的欧盟优控多环芳烃检测的标准方法。由于蔬菜和水果中PAHs的种类复杂且含量较低，故选择简单、快速的样品前处理方法尤为重要。近年来，一些常用的前处理辅助技术[5]例如超声波、加压等与传统前处理方法相结合，开发出了一些高效、经济的前处理技术。测定多环芳烃含量的方法主要有荧光分光光度法[6]、气相色谱（gas chromatography-flame ionization detector，GCFID）法[7]、气相色谱质谱（gas chromatography mass spectrometry，GC-MS）法[8]及高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）[9-10]等。本研究利用超声波辅助乙腈提取，经N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）和无水 MgSO4净化，用高效液相色谱-荧光检测（HPLC-FLD）法检测蔬菜和水果中15种欧盟优控多环芳烃，取得了较好的结果。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

1.1.1 仪器

Waters e2695液相色谱仪（带荧光检测器）、Waters PAH C18色谱柱（5.0 μm，4.6 mm×250 mm）：美国Waters公司；ST 16R型高速离心机：美国Thermo Fisher公司；KQ-250B型超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；OA-SYS型氮气吹干仪：美国Organomation；SZ-1型快速混匀器：江苏金坛实验仪器厂；Milli-Q型纯水机：美国Millipore公司。

1.1.2 色谱条件

色谱柱：WatersPAHC18（5.0μm，4.6mm×250mm）；柱温：35.0℃；流动相：乙腈＋水，梯度洗脱；柱流速：1.2 mL/min；进样体积：20.0 μL。液相色谱梯度洗脱程序见表1，液相色谱检测器条件见表2。

表1 液相色谱仪梯度洗脱程序Table 1 Gradient eluted program in HPLC

表2 液相色谱检测器条件Table 2 The conditions of HPLC detector

1.2 试剂与材料

N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）：天津博纳艾杰尔科技有限公司；无水MgSO4，纯度98%：德国CNW科技公司；15种欧盟优控PAHs混合标准溶液：苯并（c）芴、苯并（a）蒽、屈、5-甲基-1，2-苯并菲、苯并（j）荧蒽、苯并（b）荧蒽、苯并（k）荧蒽、苯并（a）芘、二苯并（a，l）芘、二苯并（a，h）蒽、苯并（g，h，i）苝、茚并（1，2，3-cd）芘、二苯并（a，e）芘、二苯并（a，i）芘、二苯并（a，h）芘，浓度均为 10 μg/mL，-18℃下保存：德国Dr.Ehrenstorfer公司；乙腈（色谱纯）：德国Merck公司。

多环芳烃标准中间液1（100 ng/mL）：德国Dr.Ehrenstorfer公司，-18℃下保存；多环芳烃标准中间液2（20 ng/mL）：德国 Dr.Ehrenstorfer公司，现用现配。

样品：按照国家食品安全风险计划，随机采集山东省17地市售蔬菜和水果各30份，共计60份。

1.3 试验步骤

1.3.1 样品处理

称取10.0 g粉碎后的蔬菜、水果样品于50 mL具塞离心管中，加入20.0 mL乙腈，振摇1 min，超声30 min，加入5.0 g氯化钠，振摇1 min，5 000 r/min离心5 min，吸取上清液10.0 mL，氮吹浓缩至2.0 mL，加入150 mg PSA和300 mg无水MgSO4，涡旋1 min，5 000 r/min离心5 min，吸取上清，过0.22 μm有机滤膜，备用。吸取10 μL，进样分析。以其标准溶液峰的保留时间进行定性，利用峰面积求出样品溶液中待测物的浓度。

1.3.2 标准曲线的绘制

分别吸取多环芳烃标准中间液2（浓度为20ng/mL）0.025、0.050、0.25、0.50、1.00 mL，用乙腈定容至 1.0 mL，配制成浓度分别为 0.50、1.00、5.00、10.0、20.0 ng/mL的标准溶液。将配制的系列标准液注入高效液相色谱分离。从低浓度到高浓度依次进样，以峰面积Y作因变量，分别以15种标准品系列浓度x（ng/mL）作自变量，绘制标准曲线。

1.3.3 样品测定

在优化的色谱条件下，吸取标准溶液及样品测试液各10 μL，注入高效液相色谱仪进行分离，进样分析。以其标准溶液峰的保留时间进行定性，利用峰面积求出样品溶液中待测物的浓度。

1.3.4 结果计算

式中：X为样品中多环芳烃的含量，μg/kg；A1为样品峰面积；C为标准溶液浓度，ng/mL；V为样品定容体积，mL；A2为标准溶液峰面积；m为样品质量，g。

1.4 试验条件优化

1.4.1 萃取溶剂的选择

由于蔬菜和水果的基体成分复杂，且多环芳烃（PAHs）的浓度水平较低，因此选择适宜的萃取溶剂是保证结果准确可靠的前提。分别选择正己烷、二氯甲烷和乙腈作为萃取剂，比较其对15种欧盟优控多环芳烃（EU-PAHs）的回收率。

1.4.2 超声提取时间优化

称取适量水果蔬菜样品6份，加入多环芳烃标准溶液，使加标后的样品中多环芳烃的浓度达5.0 μg/kg，冷冻保存24 h后，考察不同超声时间对提取效率的影响，试验考察了在 10、20、30、45、60 min 的超声提取效果，其回收率与提取时间的趋势如图1所示。

图1 不同超声提取时间平均回收率趋势图Fig.1 Trend chart of average recovery rate for different ultrasound extraction time

由图1可以看出，超声30 min～40 min平均回收率变化不大，故超声时间选为30 min。

1.4.3 分离条件和检测波长的优化

多环芳烃组分的沸点较高，色谱柱选择PAH C18（5.0 μm，4.6 mm×250 mm），分离效果良好。分别选取不同配比的水+乙腈作为流动相，从保留时间、分离效果、峰形等进行比较，确定梯度洗脱分析条件。利用紫外检测器对紫外波长扫描鉴定，利用荧光检测器扫描确定灵敏荧光波长；最终确定色谱条件，另外，对流动相流速、色谱柱温度等进行选择并优化，15种多环芳烃标准的分离效果如图2所示，该色谱条件下，15种物质均能达到基线分离。

图2 15种欧盟优控多环芳烃色谱图Fig.2 Chromatographic charts of 15 EU-PAHs

2 结果与讨论

2.1 萃取溶剂的选择

通过比较，乙腈作为提取溶剂时可获得较高的回收率，15种PAHs的平均回收率可达90.0%。而正己烷和二氯甲烷做为萃取溶剂时，平均回收率分别为67.2%和81.4%。考虑到本方法以乙腈和水为流动相，在提取过程中选择乙腈作为提取溶剂，无需溶剂置换，避免了因置换溶剂而造成组分的损失。因此本试验选择乙腈做为萃取溶剂。

2.2 方法的线性范围、检出限、回收率和精密度

用乙腈为溶剂，配制多环芳烃标准系列，浓度均为0.50 ng/mL～20.0 ng/mL。在试验条件下分离检测，每个浓度水平平行测定2次，以标准的峰面积对浓度作曲线，标准曲线相关系数见表3。

分别精密量取混合标准溶液5.00、20.0 ng/mL，加入到已得到浓度的样品溶液中，使加入后待测物含量分别为1.0 μg/kg和5.0 μg/kg，按上述色谱条件进行分析，每个样品平行进样6次测定峰面积，计算回收率和相对标准偏差。在不同的加标浓度下，加标回收率在83.6%～97.2%之间，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）4.2%～12.0%之间。方法的回收率和精密度结果见表3。

表3 方法的回收率、精密度、线性范围和检出限Table 3 Recovery，precision，linear range and detection limit of the method

由表3可见，15种多环芳烃在试验浓度范围内，线性关系良好，相关系数达0.999以上。方法的最低检出浓度检出限（detection limit，LOD）以3倍信噪比计算，检出限为0.07 μg/kg～0.10 μg/kg。（按取样10.0 g计算）。

2.3 蔬菜水果中15种欧盟优控多环芳烃浓度水平的检测

为了解市售水果和蔬菜中15种欧盟优控多环芳烃污染水平。按照全省食品安全风险监测计划，采集全省17地市市售蔬菜和水果各30份，用本方法分析了蔬菜和水果中15种欧盟优控多环芳烃的浓度水平。通过分析，15种欧盟优控多环芳烃检出8种，其中屈检出率最高，共有40份样品检出，浓度范围为0.10 μg/kg～0.81 μg/kg。60份蔬菜水果中15种欧盟优控多环芳烃的检出情况见图3。

由图3可以看出，蔬菜水果中15种欧盟优控多环芳烃以屈、苯并（c）芴、苯并（a）蒽及苯并（g，h，i）苝等 8种多环芳烃检出率较高，其中屈的检出率最高，浓度最大达 0.81 μg/kg。

图3 蔬菜和水果中15种欧盟优控多环芳烃的检出情况Fig.3 Detection of 15 EU-PAHs in vegetables and fruits

3 结论

本文采用超声波辅助乙腈提取，PSA和无水MgSO4净化，高效液相色谱仪分离，荧光检测器检测法测定蔬菜和水果15种欧盟优控多环芳烃。该方法操作简单，试剂消耗量少，且该方法检测效率高，方法检测线性范围宽，准确度、灵敏度高及检出限低，适用于蔬菜和水果中15种欧盟优控多环芳烃的检测。