富锌栽培平菇的胞外酶变化规律

冯光志，刘晓敏，黎玉婷，沈彩奕，王溢华，石玉

（武汉设计工程学院食品与生物科技学院，湖北武汉430205）

平菇（Pleurotus ostreatus）又称糙皮侧耳，隶属担子菌纲，伞菌目，侧耳科，侧耳属食用菌，是世界上栽培广泛的食用菌之一[1]。平菇肉质肥厚，味道鲜美，富含碳水化合物、蛋白质、氨基酸、维生素、矿物质等营养成分，而且还具有较高的医疗保健价值，是名副其实的健康食品[2-6]。随着生活水平的不断提高，人们对健康饮食越发重视，对平菇的需求也日益旺盛。锌是人体必需微量元素，缺锌可导致各种生理生化异常，如生长迟缓、免疫功能受损、认知障碍、过早死亡等[7]。食品中以游离态存在的锌不易被人体吸收，且具有一定毒性，通过利用平菇的富集作用，将锌盐中无机形态的锌，与平菇体内的多糖、蛋白质、核酸、氨基酸、小肽等生物分子结合，形成易于人体吸收且毒性小的有机锌，更有利于锌的免疫功能和平菇保健功能的发挥，提高平菇品质[8]。

已有研究表明不同种类金属离子及其不同浓度梯度对食用菌菌丝生长发育、生物转化率及子实体重金属含量均有影响[7-13]。平菇在栽培生长的过程中会合成多种木质纤维素降解酶，以分解秸秆和麸皮中的纤维素和木质素，通过测定平菇菌丝体生长过程中的酶活，可以考察平菇对培养基料中纤维素、木质素和半纤维素的利用情况。该试验通过袋料栽培研究不同浓度Zn2+对平菇生长和胞外酶活性的影响，确定平菇袋料栽培最适Zn2+浓度，以期为进一步开发富锌食用菌产品提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

供试菌种平菇保藏于武汉设计工程学院食品与生物科技学院实验教学中心。

硫酸锌、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、一水合柠檬酸、二水合柠檬酸三钠、葡萄糖、木糖、滤纸、羧甲基纤维素钠、可溶性淀粉、3，5-二硝基水杨酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）、酒石酸钾钠、结晶酚、无水亚硫酸钠、硝酸、高氯酸、双氧水（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；木聚糖：sigma公司。

AL104电子天平：梅特勒-托利多仪器有限公司；BXM-30R立式压力蒸汽灭菌器：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；HH-S6恒温水浴锅：国华电器有限公司；TG16-WS台式高速冷冻离心机：湘南湘仪实验室仪器开发有限公司；SW-CJ-ZG超净工作台：苏州净化设备科技有限公司；722型紫外可见分光光度计：天津市普瑞斯仪器有限公司；iCE 3500型原子吸收光谱仪：美国赛默飞世尔科技公司。

1.2 培养基

斜面培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar medium，PDA）固体培养基。

基础袋料培养基：玉米芯58%，秸秆20%，麦麸20%，石灰1%，石膏1%，与水以1∶1.2质量比均匀混合，分装于培养袋中，每袋装样量180 g。

1.3 方法

1.3.1 富锌平菇的接种栽培

在基础袋料培养基中添加硫酸锌，使Zn2+终浓度为 0、300、600、900 mg/kg，分别装袋，在无菌条件下，将活化好的斜面平菇菌丝以1 cm2菌块大小分别接种于培养袋中，每个浓度设置3个重复。

1.3.2 粗酶液的制备

在平菇生长的7个时期（1：菌丝半袋；2：菌丝满袋；3：满袋后熟；4：菌芽期；5：伸长期；6：成熟期；7：采后），分别在无菌条件下，从培养袋中称取菌丝1 g混合，置于研钵中加入10 mL的去离子水研磨，转移至离心管中，再量取5 mL去离子水洗涤研钵，一并转移至离心管中，在4℃，8 000 r/min下离心10 min，所得上清液即为粗酶液。

1.3.3 平菇菌丝生长过程中羧甲基纤维素钠酶（carboxymethyl cellulose enzyme，CMCase）活性的测定

向试管中加入800 μL 1%羧甲基纤维素钠溶液、200μL粗酶液，混匀后在35℃的水浴锅中水浴30 min，立即加入1.5 mL DNS试剂，沸水浴煮沸5 min后取出冷却，加入7.5 mL蒸馏水稀释后，在540 nm下测定含糖量，以沸水灭活的粗酶液作为对照，设3次重复。酶活力通过反应0.5 h内还原糖的变化表示，活力单位为每分钟转化葡萄糖的毫克数。

1.3.4 平菇菌丝生长过程中木聚糖酶活性的测定

向试管中加入800 μL 1%木聚糖溶液、200 μL粗酶液，方法参照1.3.3。酶活力以反应0.5 h内还原糖的变化表示，酶活力单位为每分钟转化木糖的毫克数。

1.3.5 平菇菌丝生长过程中淀粉酶活性的测定

向试管中加入800 μL 1%可溶性淀粉溶液、200 μL粗酶液，方法参照1.3.3。酶活力通过反应0.5 h内还原糖的变化表示，活力单位为每分钟转化葡萄糖的毫克数。

1.3.6 平菇菌丝生长过程中滤纸酶活性的测定

向试管中加入800 μL缓冲液、3片直径1 cm的小滤纸片、200 μL粗酶液，方法参照1.3.3。酶活力通过反应0.5 h内还原糖的变化表示，活力单位为每分钟转化葡萄糖的毫克数。

1.3.7 Zn2+含量的测定

将采收后的食用菌子实体菌盖和菌柄分开，在60℃烘箱中烘干至恒定质量，采用原子吸收光谱法测定Zn2+含量。

2 结果与分析

2.1 Zn2+对平菇生长发育的影响

不同质量浓度Zn2+对平菇菌丝生长有较大影响。随着Zn2+质量浓度的增加，菌丝生长速度加快，说明添加适量Zn2+会促进平菇菌丝生长。当Zn2+质量浓度为600 mg/kg时，平菇菌丝生长最快，随着Zn2+质量浓度的进一步增大，菌丝生长速度又逐渐下降，甚至生长被抑制。从菌丝的形态、生长势和满袋时间看，添加600 mg/kg Zn2+处理的平菇菌丝洁白、浓密、粗壮且平菇菌丝提前长满菌袋。

2.2 Zn2+对羧甲基纤维素酶分泌的影响

不同Zn2+添加量羧甲基纤维素酶活性变化趋势见图1。

图1 不同Zn2+添加量羧甲基纤维素酶活性变化趋势Fig.1 Changes of carboxymethyl cellulose enzyme activity in Pleurotus ostreatus under different Zn2+additions

从图1可以看出，在菌丝生长的前4个时期，不同Zn2+添加量的平菇胞外羧甲基纤维素酶活性均保持较低的活性，之后开始缓慢升高，在子实体成熟期，不同Zn2+添加量的胞外羧甲基纤维素酶活性均处于峰值，活性大小依次为：600 mg/kg Zn2+＞300 mg/kg Zn2+＞900 mg/kg Zn2+＞0 mg/kg Zn2+，分别为 19.87、17.15、11.75、11.42 U/g，子实体采摘后纤维素酶活性呈下降趋势。

2.3 Zn2+对木聚糖酶分泌的影响

不同Zn2+添加量平菇木聚糖酶活性变化趋势见图2。

图2 不同Zn2+添加量平菇木聚糖酶活性变化趋势Fig.2 Changes of xylanase activity in Pleurotus ostreatus under different Zn2+additions

从图2可以看出，在平菇菌丝长至半袋时，600 mg/kg Zn2+培养料胞外木聚糖酶活性最高，之后不同Zn2+添加量培养料的木聚糖酶活性均有缓慢下降，并保持稳定，后熟期后逐渐升高，在子实体成熟期，木聚糖酶的活性均达到最大，其中活性最高的是600 mg/kg Zn2+培养料，为20.49 U/g，其余由大到小依次 0 mg/kg Zn2+＞300 mg/kg Zn2+＞900 mg/kg Zn2+，最大值分别为14.34、13.48、11.22 U/g。从整个周期来看，平菇木聚糖酶在菌丝生长阶段活性较小，转入生殖阶段后小幅增加，子实体成熟前大幅提高，成熟期达到最大，子实体采摘后降低。

2.4 Zn2+对滤纸酶分泌的影响

不同Zn2+添加量平菇滤纸酶活性变化趋势见图3。

图3 不同Zn2+添加量平菇滤纸酶活性变化趋势Fig.3 Changes of filter paper cellulase activity in Pleurotus ostreatus under different Zn2+additions

从图3可知，在菌丝生长的前4个时期，不同Zn2+添加量的平菇胞外滤纸酶活性均保持较低的活性，菌芽期后开始逐渐升高，在子实体成熟期，不同Zn2+添加量的胞外滤纸酶活性均达到最大，其中活性最高的是600 mg/kg Zn2+，为8.39 U/g，其余由大到小依次为300 mg/kg Zn2+＞0 mg/kg Zn2+＞900 mg/kg Zn2+，最大值分别为6.70、4.76、4.50U/g。从整个周期来看，平菇胞外滤纸酶在菌丝生长阶段活性较小，后熟阶段前期小幅度下降后维持稳定，转入生殖阶段小幅增加，子实体成熟前大幅提高，成熟期达到最大，子实体采摘后降低。

2.5 Zn2+对淀粉酶分泌的影响

不同Zn2+添加量平菇淀粉酶活性变化趋势见图4。

图4 不同Zn2+添加量平菇淀粉酶活性变化趋势Fig.4 Changes of amylase activity in Pleurotus ostreatus under different Zn2+additions

由图4可知，在平菇菌丝长至满袋时，不同Zn2+添加量的平菇胞外淀粉酶均有小幅升高，进入后熟期后酶活开始迅速提高，并保持稳定，在子实体成熟期胞外淀粉酶活性达到最大，其中600 mg/kg Zn2+培养料活性最大值为15.97 U/g，其后分别为900 mg/kg Zn2+＞300 mg/kg Zn2+＞0 mg/kg Zn2+，采摘子实体后开始逐渐下降。不同Zn2+添加量的平菇胞外淀粉酶活性变化规律总体相近。

2.6 不同质量浓度Zn2+对平菇子实体锌含量的影响

不同质量浓度Zn2+影响着Zn2+在平菇子实体中的分布。

表1 不同质量浓度Zn2+对平菇子实体锌含量的影响Table 1 Effects of different concentrations of zinc on the distribution of zinc in the fruiting bodies of Pleurotus ostreatus

由表1可知，随着Zn2+质量浓度的增加，菌盖、菌柄的Zn2+含量均逐步增加。Zn2+质量浓度为0～600 mg/kg时，菌柄中Zn2+含量小于菌盖；而Zn2+质量浓度在900 mg/kg时，菌柄Zn2+含量逐渐高于菌盖。

3 结论与讨论

食用菌生长过程中会分泌多种木质纤维素降解酶[14]，这些酶与食用菌的生长发育和培养料的降解息息相关[15]，目前，已有一些学者对这些酶的变化规律展开研究。安琪等[16]和胡素娟等[17]以棉籽壳、玉米芯等基质发酵料栽培平菇，发现不同基质配方不影响平菇胞外酶活性的变化趋势，但影响酶活性的高低。吴周斌等[18]研究了不同培养料对真姬菇胞外酶活性的影响，发现不同培养料中真姬菇菌丝分泌的同种胞外酶，其活性在各生长发育阶段不同。另外，一些研究发现金属离子作为食用菌生长所必需的微量元素，在食用菌生长发育中也起着重要作用。文晴等[19]以平菇为试材，分别采用平板培养法和棉籽壳熟料袋栽法，研究了钾元素不同添加量对平菇生长发育的影响，表明随着钾元素添加量的增加，平板培养平菇菌丝长势和长速均呈现先增加后降低的趋势，棉籽壳熟料栽培平菇菌丝长速和生物学效率也呈现先增加后降低的趋势。孔维威等[20]研究了铜对平菇生长发育的影响，表明Cu对平菇菌丝生长、原基诱导时间、产量、子实体氨基酸、蛋白质、粗脂肪含量的影响具有显著的浓度效应。锌是人体必需微量元素，富锌食用菌成为人们迫切需求的保健美食，富锌食用菌的栽培也已经提上日程。曾健勇等[7]研究了锌对大球盖菇富集液体培养的影响，表明适宜浓度的锌富集液体培养可以显著提高大球盖菇菌丝产量、菌丝活性物质产量和生物转化率。本研究通过在袋料培养基中分别添加不同浓度的锌，考察菌体生长及培养基中纤维素酶、木聚糖酶、滤纸酶、淀粉酶活性的变化情况，为工厂化富锌栽培平菇提供最直接的数据。

本研究通过向秸秆基质中添加不同浓度的Zn2+，研究结果表明不同质量浓度Zn2+对平菇分泌的同种胞外酶，其活性在各生长发育阶段不同，但不影响平菇胞外酶活性的变化趋势，这与吴周斌等[18]的研究结果相同。在平菇生长的前4个时期，胞外酶活性均很低，表明平菇在营养生长至原基分化初期主要降解半纤维素，而在伸长期胞外酶活迅速提高，表明子实体形成期主要降解纤维素，可见平菇胞外酶活性与其生长发育阶段密切相关，并且呈现阶段性变化。不同质量浓度Zn2+对平菇胞外酶活性有较大影响，本研究中添加的600 mg/kg Zn2+，有效促进了平菇胞外酶的分泌，对平菇的富锌栽培具有一定的指导意义。