贵州不同种类茶叶的几种抗氧化成分及其抗氧化能力分析

罗冬兰，黎晓燕，2，曹森，2，巴良杰，2，*

（1.贵阳学院，贵州贵阳550005；2.贵州省果品加工工程技术研究中心，贵州贵阳550005）

茶，山茶科植物，多年生常绿木本植物，其植株形态分灌木型、乔木型和半乔木型。茶树起源于低纬度的亚热带区域，中心区大部分集中在云南、贵州、四川相连的高原山地地带。贵州位于茶树的起源中心区，是国内唯一低纬度、高海拔、寡日照兼具的区域，全省地势西高东低，自中部向北、东、南三面倾斜，西部海拔1 500 m～2 800 m，中部海拔1 000 m左右，北、东、南三面边缘河谷地带海拔在500 m以下。气候属于亚热带湿润季风气候区，温暖湿润，大部分地区年平均气温在15℃左右，年降水量多在1 100 mm～1 300 mm之间，年日照时数约1 300 h，土壤大多呈酸性或微酸性[1]。总之，贵州特点的地理环境，十分有利于茶树的生长。

目前，茶叶是仅次于水的第二大饮品，它含有丰富的纯天然酚类抗氧化剂[2]。研究表明，茶的茶多酚可以有效地清除人体内的脂自由基和氧自由基，有效的预防脂质过氧化，还有延缓衰老、抑制肿瘤的发生等功能，其中，绿茶以其清新的颜色，深受广大消费者喜爱[3]。贵州省是我国绿茶种植面积大省之一，茶叶品种丰富。遵义、黔南、安顺等地先后出现了一批名茶深加工企业，但是对贵州不同品种茶叶的特性横向比较研究鲜见报道。近年来，强抗氧化活性已经成为天然资源的筛选和评价的重要标准之一[4]。另外，随着人们消费水平的提高，茶颜色也成为茶品质的评价标准之一[5]。

本研究对贵州5种（湄潭翠芽茶、石阡苔茶、凤冈锌硒茶、贵定云雾贡茶、都匀毛尖）名优茶叶的抗氧化性成分、抗氧化活性及茶汤颜色进行评价比较，研究结果可以为提升贵州省茶叶品牌、开发茶叶深加工产品，延伸茶产业链提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 茶样品

5种贵州名优绿茶分别为A：湄潭县的湄潭翠芽茶，B：石阡县的石阡苔茶，C：凤冈县的凤冈锌硒茶，D：贵定县的贵定云雾贡茶，E：都匀市的都匀毛尖。茶叶购买于市场，茶叶均为清明节前采摘的当年新茶。

1.1.2 试剂

碳酸钠、没食子酸、过硫酸钾、福林酚、三氯化铁、氯化亚铁、吐温-80：生工生物工程股份有限公司；2，2-联苯基-1-苦基肼基（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2′-联氨-双二胺盐 [2，2′-azino-bis（3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonic acid）di-ammonium salt，ABTS]、奎诺二甲基丙烯酸酯（水溶性维生素E）（6-hyd-roxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，Trolox）、2，4，6-三吡啶三吖嗪（2，4，6-Tris（2-pyridyl）-s-triazine，TPTZ）：Sigma-Aldrich；化学试剂均为市售分析纯级。

1.1.3 仪器

UV-2550紫外分光光度计：日本岛津公司；安捷伦1100高效液相色谱仪：美国安捷伦公司；VP-ODS C-18 柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）：大连依利特公司；ColorQuest XE色差仪：美国HunterLab公司。

1.2 方法

1.2.1 茶汤的制备

将待测的5种茶叶用研钵磨成粉末状态，然后用40目筛进行过滤。取1.0 g茶叶样品置于试剂瓶中，加入250 mL沸腾的超纯水。保持试剂瓶振荡浸泡1 h后，冷却，过滤残渣，4℃避光保存，用于抗氧化成分、抗氧化活性和茶汤颜色的测定。

1.2.2 抗氧化成分的测定

1.2.2.1 茶多酚

茶多酚含量的测定采用福林酚法进行，其含量用mg/mL 表示[6]。

1.2.2.2 总黄酮

总黄酮含量的测定参照何书美等[7]的三氯化铝法测定，单位以mg/mL表示。

1.2.2.3 没食子酸

没食子酸含量的测定参照折改梅等[8]的高效液相色谱 （high performance liquid chromatography，HPLC）法，以mg/mL表示。

1.2.2.4 茶黄素和儿茶素

茶黄素及儿茶素含量的测定参考王坤波等[9]的高效液相色谱（HPLC）法，以mg/mL表示。

1.2.3 抗氧化能力的测定

1.2.3.1 铁还原氧化能力（ferric reducing antioxidant power，FRAP）法

采用FRAP法测定茶汤抗氧化活性[10]。取稀释一定倍数的茶汤50 μL，加入1.0 mL TPTZ工作液，混匀后37℃反应30 min，在波长593 nm处测定溶液吸光度。然后使用不同浓度的 Trolox（50 μmol/L～1 000 μmol/L）制作标准曲线。茶汤样品抗氧化活性（FRAP值）用达到同样吸光度所需的Trolox（Trolox equivalent antioxidant capacity，TEAC）的物质的量（mmol TEAC/100 g）表示。

1.2.3.2 ABTS法

茶汤的总抗氧化能力参照金亮等[11]的ABTS法进行测定。测定前按体积比2∶1将ABTS母液7 mmol/L与过硫酸钾溶液2.45 mmol/L进行混合，于（20±2）℃避光条件下静置过夜，反应得到ABTS阳离子溶液。将上述溶液用适量80%乙醇稀释至波长734 nm处的吸光率为0.700±0.002。取稀释好的ABTS+溶液4.0 mL，加入一定稀释倍数的0.1 mL茶汤，混匀，（20±2）℃条件下反应6 min，测734 nm处的吸光值。以Trolox（50 μmol/L～800 μmol/L）为标样制作标准曲线。最后结果用每100 g样品清除ABTS+自由基能力相当于Trolox（Trolox equivalent antioxidant capacity，TEAC）的物质的量（mmol TEAC/100 g）来表示。

1.2.3.3 DPPH法

参照金亮等[11]的DPPH自由基清除活性方法，来测定茶汤的抗氧化活性。取稀释一定倍数的0.1 mL茶汤加入到4.0 mL甲醇稀释DPPH溶液（吸光率0.700±0.002），充分混匀，在（20±2）℃条件下反应 6 h，然后在517 nm 处测吸光值。以 Trolox（50 μmol/L ～800 μmol/L）为标样制作标准曲线。最终测量结果以每100 g样品清除DPPH自由基能力相当于Trolox（Trolox equivalent antioxidant capacity，TEAC）的物质的量（mmol TEAC/100 g）来表示。

1.2.4 茶汤颜色的测定

5种茶汤颜色使用ColorQuest XE色差仪进行测定。颜色结果参数用三色参数表示，分别为 L*，a*，b*。L*指明度指数，a*、b*为色品指数。茶汤彩度（C*）=（a*2+b*2）1/2。色相角（hue angle，H°）=tan-1（b*/a*）（a*＞0，b*＞0）或H°=tan-1（b*/a*）+180（a*＜0，b*＞0）[12]。

1.2.5 数据分析处理

采用OriginPro 8.0软件对数据进行统计处理，采用SPSS19.0软件的Duncan氏新复极差法进行数据差异显著性分析（P＜0.05为差异显著，P＞0.05为差异不显著）。

2 结果与分析

2.1 抗氧化成分

5类茶叶的茶多酚、总黄酮、没食子酸、茶黄素及儿茶素含量见表1。

表1 5类茶叶的抗氧化成分Table 1 Antioxidant components of five kinds of tea

茶叶在加工过程中，首先经过杀青过程，使茶叶中过氧化酶和多酚氧化酶等酶失去活性，进而阻止了茶多酚等多酚类物质进一步被酶氧化。茶中的酚类物质是茶当中的主要抗氧化活性物质，其主要成分为儿茶素类，以α-苯基苯骈吡喃为结构基础，羟基取代基作为质子的供体，容易形成酚羟基和醌型的中间形态，并使其具有特殊的生理活性与功能，如：抗辐射、抗肿瘤、抗衰老、抑菌及抗病毒等作用，这些功能与其抗氧化能力有着密切关系[13]。通过茶多酚含量的测定，发现5类茶中茶多酚含量差异显著（P＜0.05），依次大小为：B石阡苔茶＜E都匀毛尖＜D贵定云雾＜C凤冈锌硒＜A湄潭翠芽（见表1）。

5类茶叶中总黄酮含量均比较低，A湄潭翠芽和C凤冈锌硒之间无显著差异，B石阡苔茶、E都匀毛尖和D贵定云雾之间差异显著，其中A湄潭翠芽总黄酮含量最高为0.084 mg/mL，E都匀毛尖含量最低为0.063 mg/mL（见表 1）。

在茶叶中，没食子酸是茶多酚的重要组成单元，它以酯的形式连接在儿茶素的3位羟基上，从而形成一系列的酯型儿茶素衍生物，它具有显著地抗氧化活性，并且有抗肿瘤、抗突变、抗菌等作用[8]。由表1可知，5类茶叶中没食子酸含量差异显著（P＜0.05），但大小与茶多酚含量呈现相反趋势，依次为A湄潭翠芽＜E都匀毛尖＜D贵定云雾＜B石阡苔茶＜C凤冈锌硒。

由表1可知，五类茶的儿茶素含量，差异显著（P＜0.05），且D贵定云雾含量最高，其次是A湄潭翠芽。茶黄素含量相对比较低，最高的为A湄潭翠芽0.546 mg/mL，最低的为D贵定云雾0.147 mg/mL。

2.2 抗氧化活性

2.2.1 FRAP法测定抗氧化活性

5种不同茶叶铁还原氧化能力（FRAP）比较结果见图1。

FRAP法测定抗氧化活性的原理为被检测物将Fe3+还原为Fe2+的能力，该方法操作简便、重复性高，易于标准化，已经广泛应用于茶叶及其它植物提取物的抗氧化活性检测。5种不同茶叶的铁还原氧化能力（FRAP）差异显著（P＜0.05），FRAP值大小依次为：B 石阡苔茶＜E都匀毛尖＜C凤冈锌硒＜D贵定云雾＜A湄潭翠芽，其中FRAP值最大的A湄潭翠芽是最低的B石阡苔茶的2.2倍。综上，通过FRAP法测定茶叶的抗氧化活性，得出A湄潭翠芽的抗氧化活性最高。

图1 5种不同茶叶铁还原氧化能力（FRAP）比较Fig.1 Ferric reducing antioxidant power（FRAP）of five different teas

2.2.2 ABTS法自由基清除活性测定

5种不同茶叶ABTS+自由基清除活性比较结果见图2。

图2 5种不同茶叶ABTS+自由基清除活性比较Fig.2 Compare of antioxidant activity of five different teas on ABTS+free radicals

ABTS法测定自由基清除活性过程中，ABTS经硫酸钾氧化后生产稳定的蓝绿色物质——ABTS+自由基阳离子[11]。当反应液中有供氢能力的抗氧化剂存在时，ABTS+·与之反应，进而生产无颜色的ABTS。由图2可知，5种不同绿茶对ABTS+自由基的清除活性差异显著（P＜0.05）。ABTS+自由基的清除活性大小依次为：E都匀毛尖＜B石阡苔茶＜C凤冈锌硒＜D贵定云雾＜A湄潭翠芽，其中清除活性最大的A湄潭翠芽是最低的E都匀毛尖的1.8倍。由此可知，A湄潭翠芽茶的ABTS+自由基的清除活性最好，其次是D贵定云雾茶。

2.2.3 DPPH法自由基清除活性测定

5种不同茶叶DPPH自由基清除活性比较结果见图3。

图3 5种不同茶叶DPPH自由基清除活性比较Fig.3 Compare of antioxidant activity of five different teas on DPPH free radicals

DPPH测定自由基清除活性过程中，DPPH可以提供一种比较稳定的质子自由基，它的甲醇溶液呈现紫色，并且在517 nm波长处有着最大吸收值。当反应液中有抗氧化剂提供氢能力的时候，DPPH溶液颜色变浅，且吸光值变小。可以通过测定DPPH自由基含量（吸光度）的变化来评价物质的抗氧化活性[11，14]。由图3可知，在测试的5种不同绿茶中，DPPH自由基的清除活性超过200 mmol TEAC/100 g的有A湄潭翠芽（241.67 mmol TEAC/100 g）和C凤冈锌硒（219.33 mmol TEAC/100 g），而活性最低为E都匀毛尖（177.33 mmol TEAC/100 g）、B 石阡苔茶（146.33 mmol TEAC/100 g）。研究发现，A湄潭翠芽茶相对于其它4种绿茶的清除活性较好。

2.3 茶汤颜色参数

5种绿茶茶汤颜色参数的数据分析结果见表2。

表2 5类茶叶茶汤颜色参数Table 2 Color parameters of five kinds of tea

L*表示茶汤的透明度；a*、b*为色品指数，a*表示从红色至绿色的范围，数值正数表示红色，负数表示绿色，b*表示从蓝色至黄色的范围，数值正数表示黄色，负数表示蓝色；彩度C*表示茶汤颜色的亮度或饱和度；色相角H°范围为0或360、红-紫色，90、黄色，180、绿色，270、蓝色。L*值最高的是A湄潭翠芽，最低的是E都匀毛尖，湄潭翠芽茶汤的透明度最好，而都匀毛尖的透明度最差。5种绿茶茶汤的a*值均为负值，表示5种茶汤的颜色均是不同程度的绿色，且5种茶汤之间差异显著（P＜0.05）；b*值大小决定茶汤中黄色程度，大小依次为：A湄潭翠芽＜C凤冈锌硒＜B石阡苔茶＜D贵定云雾＜E都匀毛尖，A湄潭翠芽茶汤中黄色程度最低，E都匀毛尖茶汤中黄色程度最高。5种茶汤的彩度C*值差异显著（P＜0.05），和b*值变化趋势基本一致。5种绿茶的H°都高于90，且5种之间差异显著（P＜0.05），表示茶汤的颜色均为黄绿色。

2.4 相关性分析

对茶叶的抗氧化性与抗氧化成分、茶汤的颜色进行相关性分析，结果见表3。

由表3可知，茶多酚的含量与FRAP法、ABTS法呈显著性正相关（P＜0.05），与DPPH法呈极显著的正相关（P＜0.01），相关系数分别为：0.838、0.820、0.976。结果表明，在茶叶的抗氧化成分中，茶多酚含量是影响抗氧化活性的重要因素，这与以前的研究报道一致[15]。另外，可以得出FRAP法、ABTS法和DPPH法3种方法在评价茶叶抗氧化活性时都呈现出显著的相关性，说明它们都适合茶叶的抗氧化活性测定，并且这3种方法之间可以起到相互补充的作用，这与金亮等[11]的研究报道相符合。本试验结果中，发现总黄酮含量与ABTS法和DPPH法显著性相关（P＜0.05），相关系数为0.948和0.898，这一结果表明，总黄酮的含量也影响着茶叶的抗氧化活性。茶多酚类物质是茶叶的主要抗氧化活性物质，主要是以α-苯基苯骈吡喃为结构基础的类黄酮化合物，羟基取代基作为质子的供体，使其具有特殊的生理活性与功能，直接作用于与自由基以及相关的酶[13]。黄酮类的基本结构为C6-C3-C6，以游离甙元形式和与不同糖结合形成的甙存在，由于其分子结构中具有数量不等的酚羟基而有较强的还原性，因此可以作为氢供体来还原自由基，因此黄酮类物质具有较强的清除DPPH和超氧自由基O2-·的能力，是一种很有潜力的抗氧化剂[16]。综上可知，茶多酚和总黄酮的含量是影响茶叶抗氧化活性的重要因素，由表1可知A湄潭翠芽的茶多酚和总黄酮的含量在5种茶叶中含量最高，由图1、2和3可知A湄潭翠芽的抗氧化活性最高，进一步验证了结果的可靠性。

表3 抗氧化活性与抗氧化成分及颜色参数的相关性分析Table 3 Correlation coefficients between antioxidant activity and antioxidant components and color parameters

茶汤颜色中参数a*值与FRAP、DPPH呈显著性相关（P＜0.05），与 ABTS呈极显著性相关（P＜0.01），其它颜色参数 L*、b*、C*、H°与抗氧化活性之间相关性不显著，这表明，茶叶颜色只能作为简单初步评价茶叶抗氧化活性，不能作为评价标准。

2.5 主成分分析

对抗氧化活性（FRAP法、ABTS法、DPPH法）、抗氧化成分（茶多酚、总黄酮、没食子酸、茶黄素、儿茶素）、颜色参数（L*、a*、b*、C*，H°）这 13 个变量进行主成分分析，结果见表4。

表4 主成分分析Table 4 Principal component analysis

结果表明前3个主成分可以解释92.736%的变异（表4）。其中，第一个主成分（PC1）是最重要的，解释62.315%的变异（表 5），ABTS、总黄酮、茶多酚、FRAP、及a*是对第一个主成分影响的主要特征向量，分别为0.939、0.926、0.912、0.900、0.900 （表 5）。第 2 主成分（PC2）解释 19.525%的变异，没食子酸、茶黄素、L*、b*、c*及DPPH是对第2个主成分影响的主要特征向量，分别为-0.839、-0.514、0.685、0.583、0.573、0.346（表5）。第3主成分（PC3）解释10.896%的变异，主要来自于儿茶素（表5）。

表5 前3个主成分的变异来源Table 5 Source of variation for three principal components（PC）

图4为5种茶叶在第1、2、3主成分散点分布图。

从图4中可以看出，A湄潭翠芽和C凤冈锌硒，都位于图中PC1的正区域，主要和ABTS、总黄酮、茶多酚、FRAP等相关联。从PC3分布来看，D贵定云雾处于正区域；A湄潭翠芽、B石阡苔茶、C凤冈锌硒和E都匀毛尖都处于负区域。A、B、C和E 4种在图中相距较近，表明4种茶叶相关指标差异不大，而与D茶叶在图上相距较远，表明它们相关指标差异较大。

图4 5种不同茶叶在第1、2、3主成分分布Fig.4 Scatter plot of the first two three principal component analysis of five types of tea

3 结论

使用3种评价体系比较贵州5种茶叶的抗氧性，通过试验发现结果略有不同，其原因在于每种不同抗氧化评价体系之间存在一定的差异性。贵州5种茶叶的抗氧化活性、抗氧化性成分及颜色参数存在显著性差异（P＜0.05）。通过对数据相关性分析处理，发现茶多酚与抗氧化性指标呈显著正相关（P＜0.05），而抗氧性成分及颜色参数也与抗氧化性、茶多酚有一定的相关性。通过主成分分析表明，茶多酚含量、铁还原氧化能力、ABTS+自由基清除活性、DPPH自由基清除活性等指标是评判茶叶抗氧化性的重要指标。贵州5种不同种类茶叶的抗氧化性及抗氧化成分的差别，为不同种类茶叶资料的利用提供了科学理论依据。