复配天然果汁清除亚硝酸盐及阻断亚硝胺效果的研究

闫妍，王瑞，康宏伟，杨颖晗，熊凤娇，马俪珍

（天津农学院 食品科学与生物工程学院，天津300384）

在肉制品加工过程中，通常会加入一种食品添加剂亚硝酸盐，亚硝酸盐的添加可以不仅改善肉制品色泽，增进肉制品的风味，同时可以起到一定的抑菌的作用，可以有效抑制肉制品中肉毒梭状芽孢杆菌的生长，防止肉制品腐败变质从而达到延长食品保藏期的效果。亚硝酸盐本身无致癌性，但是亚硝酸盐可以和胺类物质，特别是二级胺类物质发生反应形成致癌物N-亚硝胺[1-4]，因此控制食品中的亚硝酸盐及N-亚硝胺类化合物很有必要。亚硝酸盐作为食品添加剂，尤其在肉制品加工中起着重要作用，研究者目前还没有找到能够完全替代它的食品添加剂，但寻找有效的亚硝酸盐清除剂以及亚硝化抑制剂早已成为众多学者的研究热点[5-6]。

近年来，国内外学者利用含有黄酮化合物、茶多酚、花色苷、VC等活性成份的天然产物来清除亚硝酸盐或阻断亚硝胺的合成，效果明显[7-15]。本研究选用6种天然产物，葡萄、黄柠檬、青柠檬、石榴、菠萝、木瓜。研究表明，葡萄中含花青素、原花青素等多种酚类物质[16]，柠檬中含多种多酚、黄酮类物质、柠檬苦素等多种活性物质[17]，石榴中含有丰富的VC等营养成分[18]，菠萝中含丰富的多糖有较强的抗氧化效果[19]，木瓜中含黄酮等多种活性成分[20]。本试验通过单因素试验和正交试验，研究天然果汁清除亚硝酸盐和阻断亚硝胺的效果，优选出效果最佳的复配比例，并最终确定天然果汁用量及复配方式，为寻求有效的亚硝酸盐的清除剂和亚硝胺合成的阻断剂提供理论依据。目前，有关这方面的研究，国内尚未有报道。由于肉制品安全问题被越来越多的国家所重视，本研究对于控制食品中N-亚硝胺类化合物及提高食品安全性方面有着实际意义[21-24]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

葡萄、黄柠檬、青柠檬、石榴、菠萝、木瓜：市购。

1.1.2 试剂

柠檬酸钠、浓盐酸、亚硝酸钠、二甲胺盐酸盐、碳酸钠、1-萘胺、无水对氨基苯磺酸（均为分析纯）：天津市风船化学试剂科技有限公司。

1.2 仪器与设备

T6-1650E紫外分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；DZKW-S-4电热恒温水浴锅：上海科恒实业发展有限公司；Z36HK高速冷冻离心机：贺默（上海）仪器科技有限公司；A11艾卡分析用研磨机：艾卡（广州）仪器设备有限公司；NuAire NU-543二级A2型生物安全柜（II级A2）：天美（中国）科学仪器有限公司；KQ-500DE数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 新鲜果汁的制备

参考宋爽等[25]的研究结果，用直接榨汁法提取的果蔬汁液对亚硝酸根的清除效果优于超声法和水浴法。因此选用直接榨汁法制取新鲜果汁：新鲜水果挑选→去除果皮和籽→切成小块→清洗→榨汁机榨汁→离心→取上清液作为提取液→4℃冷藏备用。

1.3.2 天然产物提取液对亚硝酸盐的清除作用[26]

1.3.2.1 亚硝酸盐清除率的测定原理

当加入提取液时，提取液与亚硝酸钠作用将部分亚硝酸钠消耗掉，剩余亚硝酸根在酸性条件下，可以是对氨基苯磺酸重氮化，再使其与1-萘胺偶合生成红色化合物，用分光光度计测出该化合物的吸光度值可计算上述反应液中亚硝胺含量。

1.3.2.2 操作步骤

取10 mL离心管，加入0.1 mL提取液，5 mL，0.5 mol/L的pH值为3.0的柠檬酸钠-盐酸缓冲液，再加入0.5 mL，1 mmol/L的亚硝酸钠，将反应体系用缓冲液定容到10 mL，在37℃条件下保温反应30 min，取1 mL于5 mL试管中加入1%对氨基苯磺酸和0.1%的1-萘胺各1.5 mL，定容至5 mL，放置15 min显色后在波长525 nm比色测定其吸光度。

1.3.2.3 单因素亚硝酸盐清除率的测定

用已得到的葡萄、黄柠檬、青柠檬、石榴、菠萝、木瓜6种天然产物提取液进行不同质量分数提取液对亚硝酸盐清除率的测定。加入各提取液的添加量分别0、0.1%、0.5%、1%、5%、10%、20%时，按上述操作步骤进行测定，并计算各个质量分数下提取液的阻断率，进行分析。

1.3.3 清除亚硝酸盐正交试验设计

在单因素试验的基础上，设计正交试验，选择黄柠檬、菠萝、木瓜3种天然产物进行复配，得到9组不同提取液浓度组合的复配试验组。具体正交试验设计因素水平设计见表1。

表1 正交试验设计因素水平表Table 1 Coded and actual levels of three antioxidants for orthogonal array design

1.3.4 天然产物提取液对亚硝胺的阻断作用

1.3.4.1 亚硝胺阻断率的测定原理

参照郭艳华等[27]的测定原理进行测定。

1.3.4.2 操作步骤

参照马俪珍等的方法略有修改[28]。取10 mL离心管，加入0.5 mol/L，pH3.0的柠檬酸钠-盐酸缓冲液5 mL，加入1 mmol/L的二甲胺盐酸盐0.5 mL，然后将反应体系用缓冲液定容到10 mL，于37℃保温反应1 h。反应结束后，取1 mL经反应的溶液置于5 mL的试管中，加入0.5 mL质量分数0.5%的碳酸钠溶液，于15 W紫外灯照射15 min，紫外灯距离液面45 cm。取出后加入质量分数1%的对氨基苯磺酸和质量分数0.1%的1-萘胺各1.5 mL，加入蒸馏水使溶液体积精确为5 mL。放置15 min显色后在波长525 nm比色测定其吸光度。

1.3.4.3 单因素亚硝胺阻断率的测定

在清除亚硝酸盐试验研究的基础上，用上述试验选出的黄柠檬、菠萝、木瓜3种天然产物进行不同质量分数提取液对亚硝胺合成阻断率的测定。加入各提取液的添加量分别 0、1%、5%、10%、20%、30%时，按上述操作步骤进行测定，并计算各个质量分数下提取液的阻断率，进行分析。

1.3.4.4 阻断亚硝胺正交试验设计

在单因素试验的基础上，用黄柠檬、菠萝、木瓜3种天然产物最佳复配比正交试验，得到9组不同提取液浓度组合的复配试验组。具体正交试验设计因素水平设计见表2。

表2 正交试验设计因素水平表Table 2 Coded and actual levels of three antioxidants for orthogonal array design

1.4 计算

1.4.1 亚硝酸盐清除率的计算方法

式中：A1为蒸馏水代替天然产物提取液的空白对照组吸光度；A2为加入提取液按照标准操作步骤测得的吸光度。

1.4.2 亚硝胺阻断率的计算方法

式中：A0为蒸馏水代替天然产物提取液的空白对照组吸光度；AX为加入提取液按照标准操作步骤测得的吸光度。

2 结果与分析

2.1 单因素亚硝酸盐清除率的测定

不同质量分数的各种天然产物提取液对亚硝酸盐的清除率如图1所示。

图1 不同质量分数提取液的亚硝酸盐清除率Fig.1 Different concentrations of the extract for the eliminating of nitrite

由图1可见，菠萝提取液质量分数在0%～1%范围内变化时，对N-亚硝胺的阻断率范围为0%～52.1%，且当其质量分数达到1%时，阻断率最高达到了52.1%。当质量分数继续升高时，阻断作用有趋于平缓逐渐减小的趋势。同样，黄柠檬、木瓜、青柠檬、石榴、葡萄提取液均在质量分数为1%时达到最佳阻断效果。同时由图1可以看出，菠萝清除亚硝酸盐的效果最明显，其次是黄柠檬和木瓜。这3种天然产物提取液对亚硝酸盐清除率始终高于青柠檬、石榴和葡萄，由此根据单因素试验筛选出菠萝、黄柠檬、木瓜这3种清除亚硝酸盐效果较强的天然提取物，且根据单因素试验结果可知，清除亚硝酸盐最佳质量分数为1%。

2.2 亚硝酸盐清除作用最佳复配比的选择

按正交试验设计因素水平表1，最佳复配比正交试验结果见表3。

表3 最佳复配比正交试验设计及结果Table 3 The design and the results of the orthogonal experiment

续表3 最佳复配比正交试验设计及结果Continue table 3 The design and the results of the orthogonal experiment

从9个处理中直观地找出最优水平组合为5号处理，即A2B2C1，试验指标值为79.5%；通过正交试验结果的统计分析，得出最优水平组合为A2B2C1，与选出的5号处理结果吻合。经进一步试验检验得出，最优水平组合为A2B2C1，即黄柠檬提取液质量分数为1.0%，菠萝提取液质量分数为1.0%，木瓜提取液质量分数为0.8%，混合果汁对亚硝酸盐清除效果最好，清除率为79.5%，比单因素试验中最高清除率52.1%（菠萝）明显提高，天然产物提取液复配得到的果汁对亚硝酸盐清除效果最理想。

2.3 单因素亚硝胺合成阻断率

各提取液的质量分数分别0、1%、5%、10%、20%、30%时对亚硝胺合成的阻断率见图2。

图2 不同质量分数提取液的亚硝胺阻断率Fig.2 Different concentrations of the extract for the Blocking rate of Nitrosamine

由图2可知，黄柠檬提取液质量分数在0～10%范围内变化时，N-亚硝胺阻断率随着质量分数的增加有上升的趋势，且当质量分数升至10%，N-亚硝胺的阻断率最高为46.8%。但当质量分数超过10%时，N-亚硝胺的阻断率随着质量分数的增加有缓慢下降的趋势。且菠萝、木瓜提取液对N-亚硝胺的阻断率随着质量分数的增加都呈现出先上升后下降的趋势，且在质量分数为10%时对N-亚硝胺的阻断效果最佳，阻断率分别为48.1%和30.7%，因此根据单因素试验可以得出，提取液质量分数10%时阻断N-亚硝胺效果最强。

2.4 亚硝胺阻断作用最佳复配比的选择

按正交试验设计因素水平表2，最佳复配正交试验结果见表4。

表4 最佳复配比正交试验设计及结果Table 4 The design and the results of the orthogonal experiment

从9个处理中直观地找出最优水平组合为4号处理，即A2B1C2，试验指标值为49.1%，通过正交试验结果的统计分析，得出最优水平组合为A3B1C2，经进一步试验检验得出，最优水平组合为A3B1C2，即黄柠檬提取液质量分数为12%，菠萝提取液质量分数为8%，木瓜提取液质量分数为10%，对亚硝胺阻断效果最好，阻断率为51.1%，比单因素试验中最高清除率48.1%（菠萝）略有提高，天然产物提取液复配得到的混合果汁对亚硝胺有较为理想的阻断效果。

3 结论

通过清除亚硝酸盐的最佳复配比正交试验，得到的最优复配组合为1.0%黄柠檬提取液、1.0%菠萝提取液、0.8%木瓜提取液混合，清除率为79.5%，天然产物提取液复配得到的果茶汁对亚硝酸盐具有理想的清除效果；而通过阻断亚硝胺合成的正交试验，得到的最优复配组合为12%黄柠檬提取液、8%菠萝提取液、10%木瓜提取液混合，阻断率为51.1%，有较好的阻断亚硝胺合成效果。复配天然产物应用到肉类产品的生产中不仅能起到清除亚硝酸盐和阻断亚硝胺合成的效果，还能增加产品的营养和风味[29]。这为开发更加安全美味的肉类食品的开发提供了参考。