香菇液体深层发酵优化研究

韩 冰 陈 顺 于广峰 王洪奇 冀宝营 孙立梅 关艳丽 郭玲玲

（辽宁省微生物科学研究院，辽宁朝阳122000）

香菇（Lentinus edodes）隶属于担子菌纲伞菌目口蘑科香菇属，又名香菇菌、花菇、花蕈等，是目前我国生产量和消费量最大的食用菌品种之一[1]，也是世界著名食药用真菌，居全球食用菌产量第二位。2015年，中国香菇产量达767万t，占全球香菇总量的90%以上[2]。我国是世界上最早认识和栽培香菇的国家之一，至今已有800多年的历史[3]。

相对于固体菌种而言，液体菌种生产有工艺简便、周期短、菌种纯、成本低等特点[4]，目前采用液体菌种栽培的食用菌已有50余种[5]。香菇作为食用菌生产的支柱产业之一，其液体种的生产工艺是提高香菇生产效率的关键。笔者以辽西地区主栽香菇品种辽香6号为供试品种，对其深层发酵条件进行研究，以期为香菇液体菌种的生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

香菇菌株“辽香6号”，原种由辽宁省微生物科学研究院食用菌栽培研究室保藏。

1.2 试验设备及培养基原材料

（1）主要仪器：上海舜宇恒平电子天平（MP2002型）、申安立式压力蒸汽灭菌器（LDZX-75KB型）、超净工作台、中器生化培养箱（SPX-450型）、上海世平立式双层大容量恒温培养摇床（SPH-2102型）、Sigma离心机（3K15型）等。

（2）培养基原材料：葡萄糖、蔗糖、红糖、琼脂、酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、KH2PO4、Mg SO4·7H2O、玉米面、麸皮、木屑、石膏等。

1.3 试验方法

1.3.1 菌种的制备与培养料的配制

1.3.1.1 供试菌种活化

在无菌条件下，将母种菌丝接种至PDA斜面上，25℃下培养7 d后挑选菌丝浓密、洁白、健壮的试管作为供试菌种。

1.3.1.2 液体菌种的制备

将每块0.5 cm2大小的3块菌丝块接种至含100 m L供试液体培养基（基础培养基土豆10%，玉米面1%，葡萄糖1%，麸皮4%，KH2PO40.2%，Mg-SO4·7H2O 0.1%）的500 mL三角瓶中，25℃摇床培养，转速150 r/min。

1.3.2 液体菌种培养基配方的碳源、氮源筛选试验

1.3.2.1 碳源的筛选

以原有培养基配方（1.3.1.2）为基础，进行碳源的筛选，用2%玉米粉分别与1%的葡萄糖、蔗糖、红糖组合作为碳源，添加麸皮4%，KH2PO40.2%，Mg-SO4·7H2O 0.1%配制液体培养基；25℃，150 r/min条件下培养，每种培养基3个重复。测定菌丝生物量，求平均值，筛选出最佳碳源组合。

1.3.2.2 氮源的筛选

以碳源试验筛选出优势碳源组合为氮源的筛选试验培养基碳源，以2%麸皮分别与1%的酵母粉、蛋白胨、牛肉粉组合作为氮源（添加玉米面2%，葡萄糖 1%，麸皮 2%，KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O 0.1%）配制培养基，每种培养基3个重复。测定菌丝生物量，求平均值，筛选出最佳氮源组合。

1.3.3 液体培养条件优化试验

以筛选出的最适培养基配方（玉米粉2%，红糖1%，麸皮 2%，酵母粉 1%，KH2PO40.2%、MgSO4·7H2O 0.1%）液体培养条件优化试验，装量为每瓶100 mL，pH自然，接种斜面菌种，25℃恒温培养。以摇床转速、接种量和静置时间为因素，设计正交试验（表1），以菌丝生物量（湿重）为考察指标，确定香菇液体菌种培养条件的最优组合。

上述试验取发酵液各3瓶，9193×g离心10 min，弃残液，称重，得菌丝生物量，取平均数。

1.3.4 液体菌种接种培养料试验

选1%红糖和葡萄糖这两种优势碳源，分别与1%牛肉粉、蛋白胨和酵母粉组合，添加玉米粉2%，麸皮2%，KH2PO40.2%、MgSO4·7H2O 0.1%为培养基制备香菇液体菌种，以斜面固体菌种为对照，分别接入固体培养料。液体菌种接种5 mL，每个配方接种5瓶；固体种接入长2 cm斜面菌种2～3块。

接种后23℃恒温培养，每隔24 h观测液体菌种和斜面固体菌种在培养料上菌丝萌发情况，记录菌丝满瓶所需时间，测量培养料的高度，计算菌丝的平均生长速度（菌丝长速=培养料的高度/菌丝满瓶所需时间），观察并计算污染率。

表1 香菇液体菌种培养条件正交试验的因素与水平

1.3.5 液体菌种最佳发酵时间的确定

以筛选出的最适培养基配方、最适的液体培养条件培养液体菌种，培养5 d后每隔24 h取样转接3支试管，观察菌种萌发及满管时间，同时取样3瓶测定菌丝生物量，至菌丝生物量下降结束培养。

2 结果与分析

2.1 碳源组合筛选结果

试验结果见表2。由表2可见，以1%红糖+2%玉米粉组合碳源最好，获得香菇菌丝生物量最高，为11.35 g/100 mL，1%葡萄糖+2%玉米粉组合次之，1%蔗糖+2%玉米粉组合最低。因此，可确定1%红糖+2%玉米粉组合为最佳碳源组合。

表2 不同碳源组合对香菇菌丝生物量的影响

2.2 氮源组合筛选结果

试验结果见表3。由表3可知，以氮源1%酵母粉+2%麸皮，碳源1%红糖+2%玉米粉组合最好，获得香菇菌丝生物量高；氮源1%牛肉粉+2%麸皮与碳源1%葡萄糖+2%玉米粉组合也能获得较高的香菇菌丝生物量；氮源1%蛋白胨+2%麸皮与碳源1%葡萄糖+2%玉米粉组合的获得菌丝生物量最低。因此，可确定1%酵母粉+2%麸皮，1%红糖+2%玉米粉组合为最佳碳氮源组合，菌丝生物量为21.26 g/100 mL。

表3 不同氮源组合对香菇菌丝生物量的影响

2.3 液体菌种接种培养料结果

由从表4和图1、2、3可见，1%牛肉粉+1%红糖、1%酵母粉+1%红糖、1%酵母粉+1%葡萄糖为碳氮源组合培养的液体菌种，接种固体培养料后发菌、吃料速度快，结合液体菌种培养基配方的单因素筛选结果，进一步确定1%酵母粉+1%红糖为最优碳氮源组合。

表4 液体菌种在固体培养料上发菌情况

液体菌种为接种4 d后萌发（图1），固体菌种未萌发，可见液体菌种萌发明显快于固体菌种；液体菌种接种23 d后菌丝长满培养瓶（图2）；图3接种90 d产生原基及子实体（图3左、中），而固体菌种未产生原基（图3右）。由此可见，从菌种萌发、菌丝生长到原基形成液体菌种都优于固体菌种。

2.4 液体菌种培养条件优化结果

极差分析表明（表5），极差值越大，在该因素水平变动时，对香菇菌丝体生物量的影响越大。从表5可以看出，3因素的极差值大小顺序是A＞B＞C，表明试验培养条件中影响香菇菌丝体生物量的最主要因素是摇床转速。根据水平之间K值大小比较得知，最佳组合为A2B3C2。因此，试验最佳的香菇液体菌种培养条件：摇床转速150 r/min，接种4块菌种、摇前静置时间24 h。

图1 液体菌种接种4 d萌发状态

图2 接种液体菌种菌丝满瓶

图3 固、液菌种接种90 d对比

表5 香菇液体菌种培养条件优化正交试验结果

2.5 液体菌种最佳培养时间

由表6可知，发酵第8天菌丝生物量最高，发酵液黏稠，回接试管菌丝萌发较快，可确定为发酵终点。

表6 液体菌种不同发酵时间的确定

3 小结与讨论

试验确定香菇辽香6号液体培养的最适培养基配方：玉米粉2%，红糖1%，麸皮2%，酵母粉1%，KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O0.1%。最佳培养条件为：接种4块菌种（每块0.5 cm2），培养温度25℃，上摇床前静置24 h，摇床转速150 r/min，以培养8 d为宜。

不同的香菇品种所需液体发酵的营养成分会有差异，需根据菌株特点和液体发酵目的进行筛选。但培养条件却大致相同，试验培养条件可供参考。试验为摇瓶培养结果，对于大型发酵罐是否适宜，有待验证。