芳香烃受体信号通路相关基因多态性及mRNA在子宫内膜异位症发病中的相互作用

刘 娟, 陈灿明, 徐 杨, 张 伟, 张 磊

(江苏省扬州市妇幼保健院 妇产科, 江苏 扬州, 225000)

子宫内膜异位症(EMT)简称内异症，是育龄女性的常见病和多发病，严重影响女性的生活和健康[1-3]。研究[4-7]发现EMT可能与二噁英暴露有关，但其具体机制不明，对其进行分子学研究[8-10]发现，二噁英促内异症发展可能是通过改变芳香烃受体(AhR)介导的信号通路中相关基因的表达。EMT疾病的复杂性需要考虑到基因-基因交互关系在疾病中的作用。本研究探讨AhR信号通路相关基因[AHR、AhR核异位蛋白(ARNT)、细胞色素P450 1A1(CYP1A1)、AhR 阻遏蛋白(AhRR)、谷胱甘肽S转移酶1(GSTP1)、白细胞介素-1β(IL-1β)]的基因多态性，基因的mRNA以及基因-基因交互作用与EMT发病的关系，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

采用病例-对照研究，病例组为2016年12月—2019年1月扬州市妇幼保健院经手术病理确诊的卵巢EMT患者25例，平均年龄(38.46±8.74)岁。对照组为同期因盆腔包块在扬州市妇幼保健院经手术病理确诊非EMT患者25例，平均年龄(39.96±18.68)岁。病例组纳入标准: ① 手术病理确诊EMT; ② 临床病例资料完整。排除标准: ① 存在交流沟通障碍或精神疾病患者; ② 哺乳期; ③ 拒绝参加临床调查者; ④ 存在血缘或亲属关系。根据1997年美国生育学会(AFS)提出的“修正子宫内膜异位症分期法”对EMT进行分期。2组年龄、职业、生育史等一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05), 具有可比性。所有患者均告知研究目的并签署知情同意书。研究方案经院伦理委员会审查并通过。

1.2 研究方法

1.2.1 实时定量PCR法检测mRNA表达: 采集静脉血1 mL加1 mL Trizol后室温放置5 min, 放入-80 ℃冰箱，按照百泰克《血液(液体样本)总RNA快速提取试剂盒使用手册》完成总RNA提取，提取RNA进行逆转录，用实时定量PCR技术检测AHR、ARNT、CYP1A1、GADPH、GSTP1和IL-1β共6个基因的mRNA表达水平，引物由上海启因生物科技有限公司设计合成，看家基因选择GAPDH。实验操作严格按照产品说明书进行。引物序列见表1。

表1 引物序列及PCR产物大小

1.2.2 AHR、ARNT、CYP1A1、GSTP1、IL-1β基因多态性检测: 抽取2组静脉血2 mL, 置于含有乙二胺四乙酸二钠(EDTA)抗凝的5 mL试管，用盐析法提取DNA，采用定量PCR为基础的高分辨率熔解曲线(PCR-HRM)法检测AHR、ARNT、CYP1A1、GSTP1、IL-1β基因单核苷酸位点，包括AHRG 1661A: rs2066853, ARNT G522C: rs2228099, AHRR C565G: rs2292596, CYP1A1 T6235C: rs4646903, GSTP1 A313G: rs1695, IL-B C3953T: rs1143634。

1.3 统计学分析

采用SPSS 18.0软件进行数据处理。计量资料采用均数±标准差表示, 2组间计量资料用t检验进行分析。病例组和对照组基因多态位点基因型频率分别行Hardy-Weinberg平衡检验,P>0.05表明所选样本已达遗传平衡。计数资料用率表示，用卡方检验或Fisher确切概率法分析组间各基因型频率分布的差异，计算优势比(OR)及95%可信区间(95%CI)。用单纯病例研究方法，采用非条件Logistic多元回归模型中交互作用的相乘模型分析基因-基因之间的交互作用,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

所有患者中近半数人员职业为职员(48.00%), 其他职业还包括教师、农民、服务人员、医护人员、个体、学生、退休和无业。病例组与对照组在年龄、职业、生育和规律月经方面差异无统计学意义(P>0.05)。病例组中大部分患者为中重型，内异症分期Ⅲ～Ⅳ期(19/25，76.00%)。

2.1 病例组与对照组mRNA的表达水平

与对照组比较，病例组中AHR mRNA、GSTP1 mRNA和IL-1β mRNA水平显著增高(P<0.01)。病例组中ARNT mRNA水平显著高于对照组(P<0.05), 见表2。

表2 病例组与对照组6个基因mRNA的表达水平

与对照组比较, *P<0.05, **P<0.01。

2.2 病例组与对照组各基因位点频率分布的比较

6个基因多态性位点的基因频率分布在病例组和对照组中均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，纳入样本符合人群代表性。病例组与对照组中AHR 1661 G/A以GA基因型最常见; AA基因型最少见，ARNT 522 G/C以CG基因型最常见，GG基因型少见; AHRR 565 C/G以CG基因型最常见，GG基因型最少见; GSTP1313 A/G以基因型AA最常见，GG最少见。IL-1β 3953 C/T全部为野生型基因CC型，未见基因突变。CYP1A1 6235 T/C以TC基因型最常见，然而携带突变基因型CC患者EMT的危险度是纯合野生型的7.5倍(95%CI为1.29～43.69)。其他基因型的分布无显著差异(P>0.05)，见表3。

表3 AHR、ARNT、AHRR、CYP1A1、GSTP1、IL-1β基因多态性在病例组与对照组中分布[n(%)]

2.3 各基因型在EMT发病中的交互作用

CYP1A1 6235 T/C突变型与ARNT 522 G/C(OR=9.33, 95%CI: 1.47～59.48)、GSTP1313 A/G突变型(OR=13.50, 95%CI: 1.34～135.98)存在协同作用。AHR 1661 G/A突变型与AHRR 565 C/G突变型存在协同作用(OR=13.50, 95%CI: 1.34～159.98), 其他基因位点未见交互作用。见表4。

表4 基因-基因在EMT发病中的交互作用

3 讨 论

二噁英对人体的毒害作用主要是由AhR介导。AhR与二噁英具有高度亲和力，未与二噁英结合的AhR位于细胞浆，处于一种非活化状态，与二噁英结合的AhR转入细胞核与ARNT相互作用而形成转录激活因子，结合到靶基因的DNA基序生物异源物质效应元件(XRE), 启动靶基因转录，研究较多的靶基因包括细胞色素P450基因组、谷胱甘肽S转移酶(GSTP)、炎性细胞因子如白介素1等。另外, AhR阻遏蛋白(AhRR)也会被AhR激活，竞争性地与ARNT结合，作用于靶基因，遏制AhR-ANRT对基因的转录[12]。二噁英和EMT的发病的关系可能与这些解毒代谢途径相关基因的多态性有关。

3.1 单个基因多态性与EMT的关系

本研究检测了AhR介导的信号通路中6个基因6个位点的单核苷酸多态性的基因型分型。就单个基因而言，只有1个基因的单核苷酸多态性位点与EMT发病有关联，即携带CYP1A1-6235 T/C突变型CC基因型患EMT的风险增加(OR=7.50, 95%CI: 1.29～43.69)。CYP1A1属于细胞色素P450酶系(CYP450s), 是二噁英重要的I相代谢酶，其功能是激活无活性的前致癌物为致癌物。因机体的细胞在复制过程中会发生基因突变，所以可能导致细胞色素CYP1A1表现出多态性，对环境毒素的催化特性不同，在机体表现为发生疾病的不同易感性。研究[13]发现和携带CYP1A1 MspI基因型(-/-)的女性相比，携带CYP1A1 MspI(+/-)和(+/+)的女性有40%的风险发生EMT。此外，国内学者[14]报道吉林市汉族妇女中CYP1A1Exon7的Ile/Val、Val/Val基因型与EMT的易感性有关。但也有文献[15-17]报道了不一样的结果，否认二者之间存在关联性。研究结果的不一致可能与研究人群、基因型、遗传背景、种族差异、样本量以及环境污染暴露程度不同等多个因素有关。本研究人群中未发现其他的单个基因多态性和内异症之间的关系，与部分文献[15, 18]结果一致。

3.2 联合基因多态性和EMT的关系

本研究发现CTP1A1 6235 T/C与ARNT 522G/C，CTP1A1 6235 T/C与GSTP1 313 A/G基因突变型之间的协同作用增加EMT的发病风险(OR=9.33, 95%CI: 1.47～59.48;OR=13.50, 95%CI: 1.34～135.98), 比CTP1A1 6235 T/C单个基因多态性增加内异症的风险更大(OR=7.50, 95%CI: 1.29～43.69)。国内学者[19]报道吉林市汉族妇女CYP1A1 Exon7的Ile/Val、Val/Val基因型及GSTM1空白基因型二者的协同作用与EMT的易感性有关。另有学者[20]报道CYP1A1基因MspI多态性本身可能与维吾尔族及汉族内异症发病无关，而CYP1A1/MspI合并GSTM1(-/-)基因型可能与维吾尔族内异症发病有关。近期的1篇Meta分析[21]也得出类似结论。CYP1A1和GSTP1同属于解毒代谢酶，根据功能分为Ⅰ相代谢酶和Ⅱ相代谢酶。CYP1A1属于Ⅰ相代谢酶，其主要功能是激活活化环境毒物并结合形成亲电子中间产物，呈现毒性。GSTP1属于Ⅱ相代谢酶，其主要功能是将Ⅰ相代谢酶活化的毒物解毒，转化为无毒物质排出。因此如果编码Ⅰ和Ⅱ相代谢酶的某个基因位点多态性，可能会造成酶活性的改变，使得毒性物质提前被激活或解毒能力降低，不能转变成无毒物质排出体外，从而使机体对疾病的易感性增加。另外，本研究发现AHR1661 G/A与AHRR565 C/G基因突变型间的协同作用与EMT的易感性有关。AHRR的主要作用是拮抗AhR介导的信号途径，但基因位点上多态性改变，可能会引起功能异常。在台湾的汉族人群中调查也发现野生型AhR和突变型的AHRR间协同作用增加近3倍的内异症发病风险[22]。

3.3 基因多态性和基因mRNA表达

炎性细胞因子白细胞介素-1β(IL-1β)与EMT的发病有关[23]。本研究发现EMT患者血液中IL-1β mRNA的含量明显增高。但IL-1β基因3953位点CC基因型与内异症发病风险无关，本研究结果与其他中国汉族人群的报道[24-26]相符。其原因是本研究仅检测IL-1β基因上一个位点，而基因上分布多个SNP, 推测可能是基因序列上其他位点的改变调节了IL-1β的转录，据报道IL-1β表达与3953位点多态性之间无相关性[27-29]，需要探索其他功能性位点。本研究中CYP1A1基因的多态性与内异症易感性有关，同时也检测出病例组中CYP1A1mRNA水平高于对照组。此外，本研究结果表明内异症患者血液中AhR mRNA和GSTP1 mRNA水平明显增加，但这些基因的多态性仅在与其他基因多态性联合作用时才表现出与疾病易感的相关性。另外，病例组中ARNT mRNA水平较在对照组中明显增加，该基因的多态性与疾病无相关性，但其与CYP1A1基因多态性突变型基因间的交互作用与疾病的发生风险有关。考虑到基因位点上的改变可能会影响基因的转录，继而出现表达的异常，所以本研究检测基因SNP同时检测相应基因的mRNA, 但出现的结果较复杂，对这一现象的解释可能需要离体试验及扩大样本量进一步验证。