UPLC 法同时测定玉屏风颗粒中9 种成分

廖小芳， 毕晓黎， 胥爱丽， 袁春平， 李养学， 高永坚

（1. 广州中医药大学第五临床医学院， 广东 广州510405； 2. 广东省中医药工程技术研究院， 广东 广州510095； 3. 广东省中医药研究开发重点实验室， 广东 广州510095； 4. 国药集团广东环球制药有限公司，广东 佛山528303）

玉屏风颗粒源于元代《丹溪心法》 中的玉屏风散, 是治疗表虚自汗的经世名方, 由黄芪、 炒白术、 防风组成, 主要功效为益气、 固表、 止汗, 一般用于表虚不固、 自汗恶风、 面色皓白或体虚易感风邪者。 黄芪、 炒白术、 防风含有丰富的化学成分, 具有广泛的药理活性[1-7], 其中黄芪主要含多糖、 皂苷、 黄酮类成分, 具有增强机体免疫力、 抗病毒、 抗应激功效等作用[8]； 升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷具有解热、 镇痛、 清除自由基等作用[9]； 白术内酯Ⅲ具有抗炎、 促进胃肠运动等作用[10]。

目前, 对玉屏风颗粒的质量控制主要集中在测定黄芪甲苷、 黄酮类单一成分的含有量, 尚无多成分同时测定的报道[11-15]。 因此, 本实验通过UPLC法同时测定玉屏风颗粒中升麻素苷、 毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、 升麻素、 5-O-甲基维斯阿米醇苷、 芒柄花苷、 毛蕊异黄酮、 亥茅酚苷、 芒柄花素、 白术内酯Ⅲ的含有量, 为全面评价该制剂质量提供实验依据。

1 材料

1.1 仪器 Waters Acquity UPLC®色谱仪（美国Waters 公司）； XS205DU 电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）； KQ-700DE 台式数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）； AdevantageA10自动型纯水机（美国Milli-Q 公司）； JP-150A 高速多功能粉碎机（永康市久品工贸有限公司）。

1.2 试药 升麻素苷（批号S-004-180110）、 毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷（批号111920-201203）、升麻素（批号S-007-170426）、 5-O-甲基维斯阿米醇苷（批号J-002-170731）、 芒柄花苷（批号M-013-160906）、 毛蕊异黄酮（批号M-021-170614）、亥茅酚苷（批号C-018-171217）、 芒柄花素（批号C-018-171217）、 白 术 内 酯Ⅲ （ 批 号 111978-201501） 对照品购自中国食品药品检定研究院或成都瑞芬思生物科技有限公司。 乙腈为色谱纯（德国Merck 公司）； 甲醇为分析纯（广州化学试剂厂）； 液相用水为超纯水。 4 批玉屏风颗粒由国药集团广东环球制药有限公司提供, 批号171102、171219、 180111、 180203。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 ACQUITY UPLC®BEH C18色谱柱（2.1 mm×150 mm, 1.8 μm）； 流动相乙腈-水, 梯度洗脱, 程序见表1； 体积流量0.20 mL/min； 柱温30 ℃； 检测波长220 nm； 进样量1 μL。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution programs

2.2 供试品溶液制备 精密称取颗粒约0.5 g, 置于50 mL 具塞锥形瓶中, 精密加入10 mL 75% 甲醇, 称定质量, 超声（700 W、 50 kHz） 45 min,放冷, 75%甲醇补足减失的质量, 0.22 μm 微孔滤膜过滤, 取续滤液, 即得。

2.3 对照品溶液制备 精密称取各对照品适量,加甲醇制成分别含升麻素苷657.500 μg/mL、 毛蕊异 黄 酮-7-O-β-D-葡 萄 糖 苷431.040 μg/mL、 升麻素506.370 μg/mL、 5-O-甲 基 维 斯 阿 米 醇 苷539.940 μg/mL、 芒柄花苷551.170 μg/mL、 毛蕊异黄酮591.210 μg/mL、 亥茅酚苷502.23 μg/mL、芒柄花素260.530 μg/mL、 白术内酯Ⅲ98.010 μg/mL的溶液, 即得。

2.4 阴性样品溶液制备 按处方比例及制剂工艺,分别制成缺黄芪、 炒白术、 防风的阴性样品, 按“2.1.2” 项下方法制备, 即得。

2.5 方法学考察

2.5.1 线性关系考察 精密吸取对照品贮备液适量, 置于10 mL 量瓶中, 甲醇稀释至刻度, 摇匀,制得系列质量浓度的对照品溶液, 各精密吸取1 μL, 在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定。 以溶液质量浓度为横坐标（X）, 峰面积为纵坐标（Y）进行回归, 结果见表2, 可知各成分在各自范围内线性关系良好。

2.5.2 专属性考察 精密吸取供试品 （批号171102）、 对照品、 阴性样品溶液, 在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定, 结果见图1。

2.5.3 精密度试验 取同一批供试品 （批号171102）, 按“2.1.2” 项下方法制备供试品溶液,在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定6 次, 测得升麻素苷、 毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、 升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、 芒柄花苷、 毛蕊异黄酮、亥茅酚苷、 芒柄花素、 白术内酯Ⅲ峰面积RSD 分别为0.47%、 0.57%、 0.29%、 1.05%、 1.03%、1.22%、 1.41%、 0.66%、 0.54%, 表明仪器精密度良好。

2.5.4 重复性试验 取同一批供试品 （批号171102）, 按“2.1.2” 项下方法平行制备6 份供试品溶液, 在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定,测得升麻素苷、 毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、升麻素、 5-O-甲基维斯阿米醇苷、 芒柄花苷、 毛蕊异黄酮、 亥茅酚苷、 芒柄花素、 白术内酯Ⅲ含有量RSD 分 别 为 0.65%、 1.74%、 1.07%、 0.87%、1.57%、 0.51%、 1.70%、 3.39%、 1.93%, 表 明该方法重复性良好。

2.5.5 稳定性试验 取同一批供试品 （批号171102）, 按“2.1.2” 项下方法制备供试品溶液,在“2.1.1” 色谱条件下于0、 2、 4、 6、 8、 10、12 h 进样测定, 测得升麻素苷、 毛蕊异黄酮-7-Oβ-D-葡萄糖苷、 升麻素、 5-O-甲基维斯阿米醇苷、芒柄花苷、 毛蕊异黄酮、 亥茅酚苷、 芒柄花素、 白术内酯Ⅲ峰面积RSD 分别为0.19%、 1.66%、0.27%、 0.85%、 0.89%、 1.03%、 1.89%、 1.31%、0.82%, 表明溶液在12 h 内稳定性良好。

2.5.6 加样回收率试验 精密称取同一批供试品（批号171219） 约0.25 g, 共6 份, 置于50 mL 量瓶中, 加入各对照品适量, 按“2.1.2” 项下方法制备供试品溶液, 在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定, 计算回收率。 结果, 升麻素苷、 毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、 升麻素、 5-O-甲基维斯阿米醇苷、 芒柄花苷、 毛蕊异黄酮、 亥茅酚苷、 芒柄花素、 白术内酯Ⅲ平均加样回收率分别为100.75%、102.87%、 101.89%、 100.03%、 101.30%、 106.82%、96.40%、 103.94%、 99.77%, RSD 分 别 为3.48%、3.42%、 2.52%、 3.02%、 2.72%、 2.22%、 3.85%、3.25%、 2.14%。

2.5.7 样品含有量测定 取4 批颗粒, 按“2.1.2” 项下方法制备供试品溶液, 在“2.1.1”项色谱条件下进样测定, 计算含有量, 结果见表3。

表3 各成分含有量测定结果（mg/g， n=2）Tab.3 Results of content deterrmination of various constituents （mg/g， n=2）

3 讨论

本实验将供试品溶液在190 ～400 nm 波长处进行扫描, 发现220 nm 下色谱峰数目、 丰度、 分离度较好, 故选择其作为检测波长。 然后, 依次考察了提取方式（浸泡、 超声处理、 加热回流）、 提取溶剂（50% 甲醇、 75% 甲醇、 甲醇、 乙醇、 水）、提取时间 （30、 45、 60 min）、 柱 温 （25、 30、35 ℃）、 体积流量（0.18、 0.20、 0.22 mL/min）、流动相（乙腈-水、 乙腈-0.02% 甲酸、 甲醇-水）、色谱柱（ACQUITY UPLC®HSS T3 柱、 Phenomenex Luna Omaga 柱、 ACQUITY UPLC®BEH C18柱）, 发现 在ACQUITY UPLC®BEH C18色 谱 柱、 柱 温30 ℃、 体积流量0.20 mL/min、 流动相乙腈-水条件下75%甲醇提取45 min 时, 各成分色谱峰的峰形、 分离度较好。

4 结论

本实验建立UPLC 法同时测定玉屏风颗粒中升麻素苷、 毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、 升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、 芒柄花苷、 毛蕊异黄酮、亥茅酚苷、 芒柄花素、 白术内酯Ⅲ的含有量, 该方法简便、 快速、 准确, 对全面控制该制剂质量具有指导意义。