超声波辅助提取葛花总异黄酮及体外抗氧化活性研究

孙明哲

（长春职业技术学院食品与生物技术分院，吉林长春130033）

葛花（Puerariae flos）属豆科多年生植物野葛[Pueraria lobata（willd.）Ohwi]的花蕾[1-3]，是传统药食兼用的原料[4]，《神农本草经》中记载了葛花的解酒醒脾作用[5]。葛花的化学成分包括黄酮类、生物碱类、皂苷类、挥发油等，其中异黄酮是葛花的主要功效成分[6-10]，研究表明，葛花异黄酮具有降压、扩张血管、抗炎、保肝和抗氧化等功效[11-13]。但葛花异黄酮的提取、精制工艺不够先进，不够完善，限制了葛花异黄酮在食品、医药及其他领域的应用。

超声波提取法可通过对原料施加空化效应和振动作用，可明显提高效率，缩短时间，保护有效成分，应用越来越广泛[14-16]。基于现有葛花异黄酮提取工艺落后，提取率和效率较低的缺点，本文采用超声波辅助提取法对葛花异黄酮提取工艺进行优化，以柱层析法精制，并评价葛花异黄酮的体外抗氧化活性，为葛花资源的精深开发及工业化应用提供重要的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

葛花：吉林省同仁堂大药房，试验前干燥、粉碎，过80 目筛备用。

葛根素标准品：中国食品药品检定研究院；HPD-100 型大孔树脂：天津允开树脂科技有限公司；DPPH、ABTS：Sigma 公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-1700 型紫外可见光分光光度计：日本岛津公司；BSA224S 型分析天平：赛多利斯科学仪器有限公司；XMTD-8222 型数显控温水浴锅：上海精宏实验设备有限公司；CS-700Y 型多功能粉碎机：永康市天祺盛世工贸有限公司；KS-600N 型超声波萃取仪：上海柯祁仪器设备有限公司；RE-2000B 型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；FD-1B-50 型真空冷冻干燥机：北京博医康仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标准曲线的绘制

以95%的乙醇配制0.1 mg/mL 的葛根素标品溶液50 mL，分别取 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL 标品溶液置于10 mL 容量瓶中，以去离子水定容，并以去离子水为空白对照，于250 nm 处测定吸光度值[17]。线性拟合方程为：Y=12.12X-0.042（R2=0.998），在 0.002 mg/mL～0.014 mg/mL 范围内，葛根素线性良好。葛根素标准曲线见图1。

图1 葛根素标准曲线Fig.1 Standard curve of puerarin

1.3.2 葛花总异黄酮得率的测定

参照1.3.1 中的标准曲线方法测定葛花总异黄酮含量，得率计算公式为：

式中：A 为吸光度值；W 为样品的质量，g；V 为定容终体积，mL。

1.3.3 葛花总异黄酮提取工艺单因素试验

影响葛花总异黄酮得率的主要因素有5 个，分别为超声功率（50 W～400 W），乙醇浓度（40%～90%），固液比[1 ∶5（g/mL）～1 ∶30（g/mL）]，超声温度（40 ℃～90 ℃）和提取时间（10 min～60 min）等5 个因素，根据葛花总异黄酮得率高低，寻找各因素的最佳水平。

1.3.4 葛花总异黄酮提取工艺优化试验

参考单因素试验结果，以总异黄酮得率为指标，选定超声功率、乙醇浓度、超声温度和超声时间4 个因素，进行Box-Behnken 响应面设计。因素水平编码情况见表1。

表1 因素水平编码表Table 1 The levels of experimental factors

1.3.5 葛花总异黄酮的纯化

采用HPD-100 型大孔树脂对葛花总异黄酮进行纯化，将处理过的树脂放入层析柱中（6.0 cm×80 cm），上样平衡后以80%乙醇水溶液，1.5 mL/min 洗脱流速进行洗脱，收集洗脱液，减压蒸馏，冷冻干燥备用。

1.3.6 葛花总异黄酮的体外抗氧化活性测定

以纯化后的葛花总异黄酮为测试对象，测定其体外抗氧化活性，按张海容等[18]的方法测定DPPH·清除率；按曹清明等[19]的方法测定ABTS+·清除率；按周婧琦等[20]的方法测定O2-·的清除率；按王彦平等[21]的方法测定总还原力。

1.3.7 数据处理

所有试验重复3 次，试验结果以平均值±标准差来表达，试验数据分析采用SPSS 19.0 软件和Duncan 法。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 超声功率对葛花总异黄酮得率的影响

超声波萃取主要利用超声波的热学机理和机械震动，功率越大，其作用越强，进而对原料的作用就越显著[22]。超声功率对葛花总异黄酮得率的影响见图2。

图2 超声功率对葛花总异黄酮得率的影响Fig.2 Effect of ultrasonic power on the yield of total isoflavones from Puerariae flos

由图2 可知，随超声功率的增大，葛花总异黄酮的得率呈现先增加后减小的趋势，当超声功率达到250 W时，得率达到最大，为（11.54±0.14）mg/g，但功率高于250 W 时，总异黄酮显著降低，超声功率过高可能引起剧烈的空化效应，破坏化学键，引起异黄酮的结构变化，导致总异黄酮得率的降低。超声功率250 W 最佳。

2.1.2 乙醇浓度对葛花总异黄酮得率的影响

乙醇浓度对葛花总异黄酮得率的影响见图3。

图3 乙醇浓度对葛花总异黄酮得率的影响Fig.3 Effect of ethanol concentration on the yield of total isoflavones from Puerariae flos

由图3 可得，随乙醇浓度的升高，葛花总异黄酮得率呈现先增加后减小的趋势，当乙醇浓度为70%时，葛花异黄酮得率最高，达到（12.48±0.13）mg/g，表明70%乙醇与葛花异黄酮结合最为紧密，溶解性最好。因此，最佳乙醇浓度为70%。

2.1.3 固液比对葛花总异黄酮得率的影响

固液比对葛花总异黄酮得率的影响见图4。

由图 4 可得，固液比为 1 ∶15（g/mL）时，总异黄酮得率最大为（10.78±0.11）mg/g，随着溶剂体积增加，使得提取物中的其他杂质过多释放，导致总异黄酮得率降低。因此，最佳固液比为 1 ∶15（g/mL）。

图4 固液比对葛花总异黄酮得率的影响Fig.4 Effect of liquid ratio on the yield of total isoflavones from Puerariae flos

2.1.4 超声温度对葛花总异黄酮得率的影响

超声波萃取中，温度对原料中有效成分的释放起到非常关键的作用，适当的温度可促进有效成分的释放，提高有效成分的得率[23]。超声温度对葛花总异黄酮得率的影响见图5。

图5 提取温度对葛花总异黄酮得率的影响Fig.5 Effect of ultrasonic temperature on the yield of total isoflavones from Puerariae flos

由图5 可见，随超声温度的升高，葛花总异黄酮得率具有先增加后减小的变化趋势，当超声温度为70 ℃时，总异黄酮的得率最高，达到（11.18±0.13）mg/g。异黄酮类化合物对温度较敏感，温度过高则分解，致使得率降低。因此，最佳超声温度为70 ℃。

2.1.5 超声时间对葛花总异黄酮得率的影响

超声时间对总异黄酮得率的影响见图6。

由图6 可见，随超声时间延长，葛花总异黄酮得率呈现逐渐增加趋势，当提取时间达到40 min 时，总异黄酮得率达到（11.55±0.14）mg/g，此后，总异黄酮得率变化趋于平缓。超声时间过长则产品能耗增加，有效成分释放缓慢，因此，超声时间为40 min 最佳。

图6 超声时间对葛花总异黄酮得率的影响Fig.6 Effect of ultrasonic time on the yield of total isoflavones from Puerariae flos

2.2 响应面试验方案及结果

2.2.1 响应模型的建立与分析

参考单因素试验结果，以总异黄酮得率为指标，以超声功率250 W、乙醇浓度70%、超声温度70 ℃和固液比 1 ∶15（g/mL）为中心，组合设计 29 个试验方案，试验方案及结果如表2 所示，对试验数据进行方差分析，结果如表3 所示。

表2 试验方案及试验结果Table 2 The experimental design and results

续表2 试验方案及试验结果Continue table 2 The experimental design and results

表3 响应面回归模型方差分析Table 3 ANOVA for response surface quadratic model

以总异黄酮得率为响应值，建立的回归方程为：Y=-19.241+0.261A+0.358B+0.557C-0.077D+0.145AB-0.214AC-0.221AD+0.088BC-0.113BD+0.269CD+0.129A2-0.184B2-0.493C2-0.872D2。

由表3 方差分析结果可见，回归模型极显著（p＜0.000 1），相关系数R2=0.953 6，与调整负相关系数R2Adj=0.927 4 差值较小，失拟项不显著（p=0.094 3＞0.05），表明方程拟合良好；信噪比为17.615，相对较大，变异系数为1.13%，表明方程精度高，误差小，可以准确预测葛花总异黄酮得率的变化。

模型的一次项A、B 和C 对葛花总异黄酮得率影响显著（p＜0.05），交互项 AB、AD、BD 对葛花总异黄酮得率影响显著（p＜0.05），交互项 AC、CD、二次项 A2、B2、C2和D2对葛花总异黄酮得率影响极显著（p＜0.01），影响的主次顺序为 A＞C＞B＞D，即超声功率＞超声温度＞乙醇浓度＞固液比。

2.2.2 最优提取条件确定与显著性验证

通过响应面的岭脊分析，确定的葛花总异黄酮提取的最优条件如下：超声功率258.4 W，乙醇浓度73.6%，提取温度 75.6 ℃，固液比 1 ∶15.8（g/mL），葛花总异黄酮得率的理论值可达到12.38 mg/g。根据实验室及工业生产实际进行修正后，得到的葛花总异黄酮提取最优工艺如下：超声功率260 W，乙醇浓度74%，提取温度 76 ℃，固液比 1 ∶16（g/mL），以此最优工艺条件重复进行5 次试验，得到葛花总异黄酮的平均得率为（12.35±0.37）mg/g，相对误差为 0.24%，与预测值的吻合度超过99%，回归模型确定的葛花总异黄酮提取工艺真实可靠，具有实用价值。

2.3 葛花总异黄酮纯化

葛花总异黄酮的纯化选用HPD-100 型大孔树脂层析法，层析柱平衡后上样，洗脱溶剂为80%乙醇水溶液，洗脱流速为1.5 mL/min，间隔3 min 收集一次，并测定异黄酮含量，得到异黄酮洗脱曲线如图7 所示，葛花总异黄酮洗脱曲线只有一个洗脱峰，最高值出现在第19 管，即57 min 时，因此洗脱峰的收集自33 min 开始，至84 min 结束，将收集到的液体真空浓缩，冷冻干燥备用，其总异黄酮纯度为（69.37±0.72）%。

图7 葛花总异黄酮洗脱曲线Fig.7 Desorption curve of total isoflavones from Puerariae flos

2.4 葛花总异黄酮体外抗氧化活性的研究

葛花总异黄酮对 DPPH·、ABTS+·和 O2-·的清除率及总还原能力见图8。

图8 葛花总异黄酮对DPPH·、ABTS+·和O2-·的清除率及总还原能力Fig.8 DPPH·，ABTS+·and O2-·radical scavenging activities and reducing power of total isoflavones from Puerariae flos

由图8 可见，葛花总异黄酮浓度越大，DPPH·清除率越高，并在总异黄酮浓度为600 μg/mL 时达到100%（图8a），其DPPH·的清除率强于野葛块根异黄酮[24]（600 μg/mL 时清除率约40 %）和鸢尾叶异黄酮[25]（600 μg/mL 时清除率约 70%）；对 ABTS+·的清除率最大出现在总异黄酮浓度为400 μg/mL 时，最大值达到100%（图8b），其清除能力强于黑豆芽、黄豆芽和绿豆芽异黄酮[26]；对 O2-·的清除率在 0～200 μg/mL 呈线性增加，超过200 μg/mL 以后增加缓慢，至600 μg/mL时达到了最大值（图8c），其清除能力强于葛根异黄酮[27]（1 000 μg/mL 时清除率约89 %）；总还原力在6.25 μg/mL～400 μg/mL 范围内呈现较好的线性关系，且在浓度为400 μg/mL 时达到最大吸光度值，此时总还原力最强（图8d），其还原力略强于大豆异黄酮[28]。对葛花总异黄酮的DPPH·、ABTS+·和O2-·清除率进行回归分析，方程分别为：Y（DPPH·）=17.99X-6.81，R2=0.972；Y（ABTS+·）=15.12X+4.68，R2=0.927；Y（O2-·）=16.69X-18.36，R2=0.944，剂量效应明显。与对照组VC比较，虽抗氧化性稍弱，但作为天然原料，其抗氧化活性极具开发价值。

3 结论

响应面优化的葛花总异黄酮超声辅助提取条件为：超声时间40 min，超声功率260 W，乙醇浓度74%，提取温度 76 ℃，固液比 1 ∶16（g/mL），总异黄酮得率最高达到（12.35±0.37）mg/g，回归方程精确度高，试验误差较小。精制后的葛花总异黄酮纯度达到（69.37±0.72）%。葛花总异黄酮在体外对 DPPH·、ABTS+·和O2-·表现出较好的清除效果，清除率可达100%，并具有还原能力。葛花总异黄酮具有较强的体外抗氧化活性。论文后续将针对葛花总异黄酮的体内抗氧化活性及机理进行探讨。