Ifenprodil减轻大鼠蛛网膜下腔出血后脑水肿及皮质凋亡*

密琼洁， 韩 萍， 孙保亮， 张宗勇△

(1山东省脑微循环重点实验室, 泰山医学院附属医院神经内科, 山东 泰安 271016; 2临沂市妇女儿童医院神经科， 山东 临沂 276000)

蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)是一种病死率和致残率高的脑血管疾病，主要病因是颅内动脉瘤破裂而引起血液进入蛛网膜下腔。SAH后的脑损伤主要涉及神经功能缺损、血脑屏障被破坏后通透性的增加、脑组织水肿、脑血管痉挛及细胞的坏死和凋亡等病理反应[1-3]。研究观察，临床SAH患者和实验SAH模型的脑脊液中含有高浓度的谷氨酸[4-7]，过量的谷氨酸使得谷氨酸受体过度激活进而发生谷氨酸兴奋性毒性，触发钙超载而引起脑损伤[8]。谷氨酸毒性下，位于突触外的N-甲基-D-天冬氨酸(N-methy-D-aspartate,NMDA)受体Glun2B亚基(GluN2B-NMDA受体)引起钙超载及神经元死亡[9-10]。艾芬地尔(ifenprodil)是选择性抑制GluN2B-NMDA受体的负向变构剂，能特异性地结合在受体的氨基末端结构域[11]。目前酒石酸艾芬地尔作为临床药物在日本和法国用于脑梗死后遗症和脑出血后遗症伴随的头晕等症状的改善，但该药对SAH后脑损伤的影响，尤其是SAH后脑水肿及细胞凋亡的影响还不清楚。

本研究通过颅内血管穿刺法制作稳定的大鼠SAH模型，探讨艾芬地尔对SAH后神经功能缺损、血脑屏障通透性、脑水肿及皮质细胞凋亡的影响，为临床SAH患者的治疗提供实验依据。

材 料 和 方 法

1 实验动物和分组

SPF级成年雄性SD大鼠(体重270～320 g，10周龄)，购买自济南朋悦实验动物中心，动物合格证号：SCXY(鲁)20140007。饲养室温23～25 ℃，相对湿度60%～65%，分笼饲养，环境通风良好，食物及水分按时摄入，12 h光/暗周期循环。将90只大鼠分为3组：假手术(sham)组(n=18)、 SAH+安慰剂(SAH+vehicle)组 (n=36)和SAH+ifenprodil组 (n=36)。所有动物实验均经泰山医学院动物伦理委员会批准。

2 方法

2.1大鼠SAH模型制作及实验设计 采用颈内动脉穿刺法建立 SAH 实验动物模型[12-13]。实验大鼠采用10%水合氯醛麻醉(腹腔注射,4 mL/kg), 将麻醉好的大鼠仰卧固定到手术台上，颈部用碘伏擦拭，沿颈中线剪2 cm皮肤切口，小心分离出右侧颈总、颈内和颈外动脉，电凝并切断颈外动脉外侧及内侧的2个分支后，结扎右颈总动脉近心端，右颈外动脉远心端，并在距颈动脉分叉部5 mm处结扎颈外动脉。然后，用显微镊子把4-0线栓逆向插入颈总动脉进而颈内动脉，入颅内约18 mm而且有阻力感，再推入2～3 mm并伴随有突破感，停留10 s，将线栓退出，以保证颈内动脉再灌注，缝合并消毒切口。假手术组仅使得线栓至有阻力感停止，其余手术步骤与上述方法相一致。3组的死亡率如下：假手术组0%，18只均存活； SAH+安慰剂组33.3%，36只中12只死亡；SAH+ifenprodil组27.8%，36只中10只死亡。每组存活的大鼠处理如下:伊文思蓝(Evans blue)法评估血脑屏障通透性实验 (n=6)，分离脑组织用于脑水肿检测和Western blot样品制备 (n=6)，以及制作脑组织冰冻切片 (n=6)。

2.2SAH grade评分 SAH的严重程度是通过18分的SAH分级评估系统完成的[14]。通过Willis环及脑底部动脉分为6个节段，根据每个节段内蛛网膜下腔出血血块的数量，将每个节段分为0～3分。评分0:无蛛网膜下腔出血；评分1:少量的蛛网膜下腔血块；评分2:中度的蛛网膜下腔血凝块但可见动脉；评分3:蛛网膜下腔血凝块覆盖所有动脉。SAH grade评分总和由所有6个节段的分数计算出来的。实验选取12～13分的SAH模型，低于或者高于此范围的SAH大鼠将被排除在实验之外。

2.3腹腔注射ifenprodil 在术后2 h、24 h和48 h，腹腔注射给予安慰剂(含5% DMSO的无菌水) 或10 mg/kg ifenprodil (ab120111, Abcam；溶解于5% DMSO的无菌水)。

2.4神经功能评分 在术后72 h, 实验双盲者采用Garcia神经功能学评分评估SAH后神经功能缺损[14]。包括6项测试：得分0～3(自主运动检测、四肢活动检测、前爪运动及力量)和1～3(身体的本体感觉、攀爬实验检测和触觉实验检测), 评分通过所有6项测试的分数相加得到。评分分为3个等级：1～6分为重度神经功能损伤，7～12分为中度神经功能损伤，13～18分为轻度神经功能损伤。

2.5干湿重法检测脑水肿 在术后72 h, 通过干湿重法检测SAH后脑水肿情况[12]。将脑组织迅速分离为左侧和右侧大脑半球，称得脑组织湿重，然后于100 ℃烘箱中烘3 d，称得干重，脑组织含水率(%)=(湿重-干重)/湿重×100% 。

2.6Evans blue法检测血脑屏障通透性 在术后71 h, 采用伊文思蓝法评估血脑屏障通透性[12]。大鼠采用10%水合氯醛麻醉(腹腔注射,4 mL/kg), 将麻醉好的大鼠仰卧固定到手术台上，股静脉注射2%伊文思蓝(3.3 mL/kg)，待循环1 h后，打开胸腔，用12号针头经左心室插入心脏，并在右心耳处剪口，用恒流泵将60 mL 0.9%等渗盐水灌注入心脏，行断头取脑，迅速分离出脑组织。精确称量脑皮质组织质量，置于50%(W/V)的三氯乙酸匀浆，匀浆液与等体积的混合溶液(无水乙醇∶三氯乙酸=3∶1)置于摇床上孵育12 h，然后离心取上清液。在96孔板上，设置空白孔、对照孔、伊文思蓝不同浓度孔(0、0.5、1、2、4、6、8和10 μg/L)及待测样品孔，在酶标仪激发波长620 nm、发射波长680 nm下测定吸光度(A)值。在Excel中根据伊文思蓝不同浓度对应的A值绘制标准曲线，计算出样品中的伊文思蓝含量，以假手术组的数值为标准1，得出各组伊文思蓝溢出量的相对变化。

2.7TUNEL染色 在术后72 h，TUNEL染色检测皮质区细胞凋亡[15]。大鼠采用10%水合氯醛麻醉(腹腔注射,4 mL/kg), 经心脏反式灌注4%多聚甲醛后，取脑并用OCT试剂包埋，使用冰冻切片机切片(10 μm厚, 前囟开始至-3 mm)。取冠状位脑切片，用0.1% TritonX-100破膜5 min，使用TUNEL试剂盒(#11684795910, Roche)染色90 min, 然后PBS洗涤3遍，用含有DAPI的防止荧光淬灭剂封片，然后用免疫荧光显微镜观察，ImageJ软件对图片分析。

2.8Western blot 在术后72 h，采用Western blot检测皮质区Bcl-2、Bax和activated caspase-9/3表达[15]。大鼠采用10%水合氯醛麻醉(腹腔注射,4 mL/kg), 选取Willis环两侧，以分离基底皮质组织，用蛋白质提取试剂盒(BC3710, Solarbio)提取大脑皮质总蛋白,然后用BCA蛋白检测试剂盒(PC0020, Solarbio)测定蛋白浓度。SDS-PAGE分离制备好的蛋白样品，并将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，然后用5%的脱脂牛奶进行封闭。膜分别与I抗[Bcl-2 (1∶200)和Bax (1∶200)，Santa Cruz Biotechnology； activated caspase-9 (1∶1 000)、 activated caspase-3 (1∶1 000)和β-actin (1∶1 000)，Cell signaling technology]在4 ℃下孵育过夜；TBST缓冲液洗涤膜3遍后，用抗兔或抗小鼠IgG酶联抗体(1∶3 000)在室温下孵育2 h，然后再用TBST缓冲液洗涤3遍，加入化学发光底物，利用凝胶成像系统观察蛋白条带，ImageJ软件对图片分析。

3 统计学方法

实验数值以均数±标准误(mean±SEM)表示，使用GraphPad Prism 7.0软件通过单因素方差分析进行统计学分析, 以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 SAH程度分级、神经功能评分、伊文思蓝溢出量及脑组织含水率

SAH后，颅底表面、Wilis环及脑干上存在显著出血点，图1A。在SAH grade上，SAH+安慰剂组与SAH+ifenprodil组之间没有显著差异(P>0.05)，见图1A。在SAH术后72 h，SAH+安慰剂组的神经功能分低于假手术组，说明SAH后有神经功能的缺损，而SAH+ifenprodil组的神经功能评分高于安慰剂组(P<0.05)，图1B。在SAH术后72 h，假手术组伊文思蓝几乎无溢出；SAH+安慰剂组与SAH+ifenprodil组均有伊文思蓝溢出，但ifenprodil组的伊文思蓝含量低于安慰剂组 (P<0.05)，见图1C。类似地，与假手术组比较，SAH+安慰剂组的大鼠左、右脑半球的脑组织含水率显著增加 (P<0.05)， 而SAH+ifenprodil组的脑组织含水率相较于SAH+安慰剂组显著降低(P<0.05) ，见图1D。

2 TUNEL染色结果

在SAH 后72 h，SAH+安慰剂组基底皮质的TUNEL阳性细胞数显著增加，假手术组不显著；相比SAH+安慰剂组，SAH+ifenprodil组的TUNEL阳性细胞数显著减少(P<0.05)，见图2。

3 Bcl-2、Bax和activated caspase-9/3表达

在SAH 后72 h，与假手术组相比较，Western blot检测显示SAH+安慰剂组的Bcl-2水平降低，而Bax及activated caspase-3/9表达上调；与SAH+安慰剂组相比，SAH+ifenprodil组的Bcl-2表达上调，Bax及activated caspase-3/9表达下调 (P<0.05),见图3。

讨 论

SAH后早期脑损伤涉及一系列病理生理的级联反应，如炎症反应、血脑屏障的破坏、脑水肿和细胞凋亡等，这些级联反应与SAH后认知及运动感觉运动障碍有密切关系[16]。有研究表明，美金刚作为NMDA受体的拮抗剂，在SAH动物模型上能够减轻SAH后的脑损伤、脑血管痉挛及神经功能的缺损[17-18];另有研究表明，选择性NMDA受体NB2B亚型的拮抗剂RO25-6981可使SAH后大鼠的认知功能障碍进一步加重[19]；本研究通过血管内穿刺法制作SAH大鼠模型，观察到SAH后有明显的神经功能缺损，而ifenprodil能改善SAH引起的神经功能缺损，对于其在认知功能障碍方面的影响有待于进一步研究。Ifenprodil作为选择性GluN2B-NMDA受体拮抗剂，能够阻断兴奋性谷氨酸毒性导致的Ca2+大量内流，从而起到保护神经细胞钙超载的作用。这可能是ifenprodil改善SAH后神经功能缺损的原因。本研究利用伊文思蓝法观察，ifenprodil能降低SAH引起的血脑屏障通透升高。有文献报道表明，脑血管内皮细胞上表达NMDA受体，谷氨酸能通过激活内皮细胞上的NMDA受体而引起内皮细胞的完整性降低，进而引起血脑屏障破坏[20]；在SAH实验动物模型上，NMDA受体的拮抗剂felbamate能够减轻神经功能缺损及血脑屏障通透升高[21]。基于文献和本研究，我们推测SAH后谷氨酸毒性可能通过激活NMDA受体引起脑血管内皮细胞完整性降低，而ifenprodil能够抑制GluN2B-NMDA受体介导的钙超载，进而保护血脑屏障。在SAH后，在早期脑损伤中存在脑组织水肿的现象。本研究显示，ifenprodil可以减轻SAH后的脑水肿。有文献报道，SAH后水通道蛋白AQP4表达升高，而且和脑水肿形成一致[22]；ifenprodil能够下调AQP4表达[23]。我们推测ifenprodil可能抑制了SAH后AQP4的表达，而减轻SAH后脑水肿，有待于进一步实验证实。

Figure 1. The effect of ifenprodil on neurological score, Evans Blue dye extravasation and brain water content at 72 h after SAH. A: the representative images showed rat brains in vehicle- and ifenprodil-treated SAH groups, and the bar chart showed that there was no statistical difference in SAH grading between vehicle- and ifenprodil-treated SAH groups; B, C and D: ifenprodil increased neurological score, and reduced Evans Blue dye extravasation and brain water content at 72 h after SAH. Mean±SEM.n=6.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsSAH+vehicle group.

图1 Ifenprodil对SAH后神经功能评分、伊文思蓝溢出量及脑组织含水率的影响

Figure 2. Ifenprodil reduced the TUNEL-positive cells in basal cortex at 72 h after SAH. The scale bar=50 μm. Mean±SEM.n=6.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsSAH+vehicle group.

图2 Ifenprodil减少SAH后基底皮质区TUNEL阳性细胞数

Figure 3. Ifenprodil increased the Bcl-2 expression, and decreased the Bax, activated caspase-9 and activated caspase-3 protein levels in basal cortex at 72 h after SAH. Mean±SEM.n=6.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsSAH+vehicle group.

图3 Ifenprodil 增加SAH后Bcl-2表达，减少Bax和activated caspase-9/3蛋白表达

在SAH后，过多的谷氨酸引起的兴奋性毒性导致细胞内Ca2+和Na+的升高，进而导致线粒体功能障碍，这是突触后神经元凋亡的原因[24]。NMDA受体拮抗剂可以破坏谷氨酸释放和过量受体激活之间的正反馈环路。本研究显示，SAH后基底皮质区存在明显的细胞凋亡，而ifenprodil能够减少此细胞凋亡。文献报道，Bcl-2和Bax蛋白的构成比例是细胞凋亡调控的关键，当Bcl-2蛋白被抑制时，Bax形成同源二聚体而诱导细胞凋亡；当Bcl-2蛋白表达增加时，可与Bax形成异源二聚体而抑制细胞凋亡[25]。本研究显示，SAH引起Bcl-2表达下调，Bax表达上调，这意味着Bax比例增多而诱导细胞凋亡，而ifenprodil能够增加Bcl-2并且降低Bax表达。当Bax表达升高后，往往引起线粒体膜通透性增加，释放线粒体色素C而引起活化caspase-9激活，随后活化caspase-3激活，最终引起细胞凋亡。本研究观察，ifenprodil能够减少SAH引起的活化caspase-9/3激活，进一步证实了ifenprodil可以抑制SAH后的细胞凋亡，而发挥脑保护作用。

综上所述，ifenprodil可能通过抑制兴奋性毒性导致的GluN2B-NMDA受体过度激活来缓解SAH后早期脑损伤，表现在可以减轻神经功能缺损和脑水肿，降低血脑屏障的通透性，抑制基底皮质区细胞凋亡。本研究结果可能为酒石酸艾芬地尔临床用于SAH的治疗提供了参考资料。