耐酸性α -淀粉酶在酸面团面包抗老化中的应用

王俊英，任 璐，王 强，李 玉，李文钊，路福平

(1.天津科技大学生物工程学院，天津 300457；2.食品营养与安全国家重点实验室，天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457)

新制作的面包具有较好的口感、较松软的组织结构且富有弹性，但是在贮藏期间，面包会出现由软变硬、组织结构松散粗糙、口感变差以及特有风味消失的老化现象[1].目前，在世界范围内，由于老化而造成了食品的大量浪费，因此如何延长食品的货架期就成为科研人员关心的话题.采用酸面团可以延缓老化现象，酸面团是由水和面粉经由酵母和乳酸菌发酵而成的混合体系[2-3].酸面团可以提高面包的质量和营养，由酸面团发酵而制作的面包具有很多优势，如赋予面包浓郁的香味、提高面包的感官品质、延缓面包的老化、防止面包因染菌而引起的腐败、延长货架期[4-6].研究[7-9]表明，酶制剂的使用也可以延缓面包的老化，其中α-淀粉酶是最常用的酶制剂.但由于细菌α-淀粉酶容易导致面包心发黏的问题[10]，因此真菌α-淀粉酶更适合于面包的生产.

目前，用于小麦面包的商业真菌α-淀粉酶大多来源于曲霉属[11]，最适pH 为5.5～6.0.采用酸面团发酵面包通常会使面团pH 更低，显然，大多数α-淀粉酶在此环境下将迅速失活，必然限制了α-淀粉酶在酸面团面包的应用.到目前为止，很少有适合于应用到酸面团面包的耐酸性α-淀粉酶的报道[12].本实验室通过前期研究[13]发现，黑曲霉来源的α-淀粉酶AmyE 在pH 4.5 具有最好活性，且pH 在4.0～5.0 稳定.本文以不添加淀粉酶的样品作为对照，比较商业α-淀粉酶与新型AmyE 对酸面团面包老化的影响.

1 材料与方法

1.1 实验原料与仪器

植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，天津科技大学乳制品微生物保藏中心；活性干酵母，安琪酵母有限公司；商业α-淀粉酶(CA，米曲霉来源)，上海源叶生物技术有限公司；耐酸性α-淀粉酶AmyE，本实验室制备；商业小麦高筋粉(基本成分：水分13.2%、脂肪 2%、蛋白质 23%、灰分 0.7%、总膳食纤维2.6%)，新良粮油加工有限责任公司；盐、白砂糖、葵花籽油为市售食品级.

HM740 型多功能厨师机，青岛汉尚电器有限公司；CF-3500 型家用发酵箱，中山卡士电器有限公司；CRWF32KE 型烤箱，佛山市伟仕达电器实业有限公司；BVM6630 型面包体积测定仪，瑞典波通公司；TA.XT.Plus 型质构仪，英国高德明科技有限公司；S20K 型pH 计，梅特勒仪器有限公司；722N 型分光光度计，北京谱析通用仪器有限责任公司；60 Plus/60 A 型差示扫描量热仪，日本岛津公司.

1.2 酸面团面包的生产工艺

1.2.1 工艺流程

植物乳杆菌的活化与培养→酸面团的制备→发酵→面包面团的制备→醒发→分割做型→烘焙→包装→储藏

1.2.2 操作要点

植物乳杆菌的活化与培养：取活化的植物乳杆菌置于MRS 肉汤培养基中30 ℃增殖培养12～16 h 至对数生长期(菌体浓度达到108mL-1)，5 000 r/min 离心20 min，收集乳杆菌细胞，冲洗2 次，用灭菌的0.15 mol/L 的氯化钠溶液重悬(菌体浓度达到109mL-1)，用于面团接种.

乳酸菌酸面团的制备：100 g 小麦高筋面粉、100 mL 去离子水[14]、10 mL 的标准化植物乳杆菌悬液制备酸面团，将酸面团放入恒温恒湿培养箱中30 ℃发酵16 h[15].

面包面团的制备与醒发：称取小麦高筋粉(100%计)、活性干酵母(1.5%)、乳酸菌酸面团(20%)，盐(1%)、白砂糖(6%)、葵花籽油(3%)、商业α-淀粉酶(15 U/g)或耐酸性α-淀粉酶 AmyE(0、10、15、20 U/g)、纯净水(60%)，使用HM740 型多功能厨师机搅拌10 min，混合好的面团置于醒发箱中38 ℃、65%相对湿度醒发1 h 后成为酸面包面团.空白对照为不加任何淀粉酶的面团，其他条件相同.

面包的制备：醒发好的面团统一分割成每个80 g，做型.将烤箱温度设定为上层 185 ℃、下层180 ℃，放入面团烘焙30 min.烘焙结束后，将面包从模具中取出，放在货架上室温冷却90 min，装入聚乙烯食品袋包装[16].

面包的储藏：将完成包装的面包于室温(25 ℃)放置7 d，分别在0、1、3、5、7 d 取样检测.每组样品作6 个平行取平均值.

1.3 应用分析

1.3.1 pH、总酸度与还原糖含量的测定

取10 g 面包面团或面包样品，放入90 mL 无菌蒸馏水均质.用pH 计测定溶液的pH；面团的总滴定酸度采用滴定法测量，使用0.1 mol/L 的NaOH 溶液中和均质液直到pH 达到8.1.总滴定酸度(TTA)用消耗的NaOH 溶液的体积(mL)表示.所有的测定至少重复3 次取平均值.

称取10 g 面包面团或面包样品，加入90 mL 的蒸馏水，放在磁力搅拌器上，调节温度达到50 ℃，搅拌30 min 使溶液充分搅匀.5 000 r/min 离心5 min.使用改良的DNS 法对上清液中的还原糖含量进行测定[17].

1.3.2 面包的感官评定

请20 名人员对面包进行感官评定，结果取平均值，感官评定的标准[18]见表1.

1.3.3 面包的质构特性

每个面包选取面包心，切成2 cm×2 cm×2 cm大小，使用TA.XT.Plus 质构仪进行全质构分析.选用P36R 探头，采用TPA 检测模式，测试速度为1.0 mm/s，压缩到原始高度的50%，第1 次和第2 次压缩之间的松弛时间为5 s[19].每个样品测5 次并取平均值.

表1 酸面团面包感官评分标准Tab.1 Sensory evaluation standards of sourdough bread

1.3.4 面包中心的水分含量

面包中心水分含量按GB/T 5009.3—2016[20]方法进行测定.

1.3.5 面包的回生焓检测

面包的回生焓采用60 Plus/60 A 差示扫描量热仪(DSC)进行测定.称取5 mg(干基)的面包冻干粉末放入DSC 盘，加入蒸馏水，使水与面包的质量比为3：1，DSC 盘密封后，室温下平衡过夜，以10 ℃/min的速率加热DSC 盘，使温度从25 ℃升温到120 ℃，同时以空的DSC 盘作为对照.

1.4 数据统计分析

使用SPSS 19.0 软件计算分析，数据结果以“平均值±标准差”表示.

2 结果与讨论

2.1 面团及其面包的pH、TTA和还原糖含量

刚混合好的面包面团(醒发前)、醒发后面团以及面包的pH、TTA 和还原糖含量的测定结果如图1所示.

随着面团醒发的进行，面团的pH 总体呈下降趋势.在发酵初期，面团含有大量的空气，酵母主要通过有氧呼吸作用进行繁殖和代谢.随着氧气逐渐被消耗，酵母开始进入无氧发酵阶段，产生二氧化碳的过程中会产生乳酸，导致面团 pH 大幅降低(图1(a)).与对照相比，在同一时期，加酶的样品具有较低的pH 和较高的TTA(图1(b))，并且AmyE 比CA的作用更加明显.α-淀粉酶是一种糖苷水解酶，催化淀粉中的α-(1，4)-糖苷键产生葡萄糖、麦芽糖和糊精等[21].植物乳杆菌通常利用一些糖类如葡萄糖、麦芽糖、果糖作为能源，用于维持细胞生存和繁殖[22].由图1(a)可以看出，混合面团的pH 在4.48～4.53 范围内，而醒发后面团的pH 在4.17～4.35 范围内.α-淀粉酶的活性与pH 有关.CA 最适pH 范围是5.0～5.5，而AmyE 最适pH 范围是4.0～5.0，且在pH 4.5时活性最强[13].因此混合面团中的pH 环境非常有利于AmyE 发挥作用.

图1 混合面团、醒发面团和面包的pH、TTA和还原糖Fig.1 pH value，TTA and reducing sugar of mixed dough，proofed dough and bread

与对照相比，添加AmyE 使基质中还原糖的水平也随之增加(图1(c)).还原糖含量的提高，对酵母和乳酸菌的生长和新陈代谢都会产生积极的影响.酸面团面包具有很多优点，如改善面包的风味和较强的抗菌性能，这些都与乳酸菌的新陈代谢密切相关[2,23].另一方面，增强了酵母的代谢活动，使之释放出更多的二氧化碳，从而使面包比容增大及具有较柔软的质地.

2.2 新鲜面包的感官评定

不同酸面团面包的感官评定结果见表2.新鲜面包的总体得分都在85 分以上，基本达到正常面包应有的品质.与对照相比，加入α-淀粉酶后，面包表面色泽金黄，切片具有多而均匀的气孔结构，面包香味更加浓郁，口感更加松软.其主要原因是添加α-淀粉酶增加了面团中的还原糖含量，从而增强了酵母的代谢活动，产生更多的二氧化碳气体，使面包的体积增大，口感更加松软[24].同时，还原糖在面包烘焙过程中还可参与美拉德反应，有助于增加面包的外表色泽.

表2 不同酸面团面包的感官评定结果(分)Tab.2 Sensory evaluation of different bread samples

2.3 面包储藏过程中的质构变化

质构分析已被证明与相关的感官评定密切相关，并且可以用这些指标评估面包的质量[25].不同面包样品在储藏过程中质构的变化如图2 所示.

面包在储藏期间，随着时间的延长，面包心的硬度和咀嚼度逐渐上升，弹性逐渐下降.因此，这些变化的速度决定了面包的质量.添加不同种类及不同浓度的α-淀粉酶对面包心质构的影响较大.与空白对照相比，添加AmyE 后可以显著降低面包心的硬度和咀嚼度，增加其弹性.其中，添加量为15 U/g 效果最好，并且优于等量的CA.不同类型的面包心样本在内聚性方面显示出无显著差异.

综上所述，添加AmyE 的面包样品在储藏过程中的质构变化要优于对照组和同等加酶量的商业α-淀粉酶组，其主要原因可能是AmyE 水解淀粉生成较多的还原糖，进而可以增强酵母的代谢活动，软化面团，改善面团的特性，因此有效减缓了面包的硬化和老化.这些结果与Roy 等[16]和Halima 等[26]使用α-淀粉酶有效地改善了面包心在储存期间的质构变化、降低了老化速率的研究结果一致.

图2 不同面包样品在储藏过程中质构的变化Fig.2 Texture properties of different bread samples during storage

2.4 面包储藏过程中水分含量的变化

将包装好的面包在室温放置7 d，不同面包样品水分含量在储藏过程中的变化结果如图3 所示.

水分在面包老化中扮演着重要的角色.在面包储藏过程中，水分会从面包心向面包皮迁移，导致面包心变硬、变干，因此失去了它的弹性和柔软性，使口感和外形变差.由图3 可知，所有面包心的水分含量在储藏期间都是持续减少的.但加入α-淀粉酶后，面包在贮存期间水分的散失明显减缓，添加AmyE的面包样品在储藏7 d 后水分含量(26.7%)高于添加CA 的水分含量(23.2%).其原因可能是AmyE 水解淀粉生成了具有亲水作用的低聚糖(主要是麦芽糖和麦芽三糖)[13].有研究[27-28]表明小分子质量的低聚麦芽糖，尤其是麦芽三糖和麦芽糖，可以作为保鲜剂，延缓面包的老化.

图3 不同面包样品水分含量在储藏过程中的变化Fig.3 Variation of moisture content in different bread samples during storage

2.5 面包储藏过程中回生焓的变化

为进一步探究面包老化的原因，差示扫描量热法(DSC)被用来检测面包储藏过程中淀粉的回生，不同面包样品的回生焓变化如图4 所示.由图4 可以看出：刚烤出的面包检测不到吸热转变；面包储藏过程中，淀粉会出现回生，随着贮存时间的延长，所有样品的回生焓增加；对照组样品的回生焓上升很快，5 d后趋于平衡.添加α-淀粉酶样品的回生焓上升趋于缓慢，而且不同的α-淀粉酶种类(如AmyE 和商业α-淀粉酶)及不同添加量对回生焓的影响也不同，其中添加15 U/g AmyE 样品的回生焓上升趋势最缓，在第7 天时，回生焓比对照降低了26.3%.

图4 不同面包样品的回生焓在储藏过程中的变化Fig.4 Retrogradation enthalpy of different bread crumb samples during storage

面包老化是一个复杂的现象，它受到多种因素的影响.虽然科研人员对其进行了大量研究，但其机制仍然不清楚.推测老化主要涉及几个不同的因素，如淀粉的回生、麦谷蛋白-淀粉的相互作用及水分的再分配[29].其中淀粉回生对面包的老化起着非常重要的作用[30].直链淀粉的含量较高及支链淀粉侧链长度较长会加剧淀粉回生的程度.α-淀粉酶能水解淀粉链上的α-1，4-葡萄糖苷键，因此能减少直链淀粉的含量，并且使支链淀粉的分枝侧链变短，使之变得小簇[31]，从而减缓淀粉的回生.此外，AmyE 水解淀粉的产物中含有小分子产物，如麦芽低聚糖具有较强的吸水性，减少了淀粉与麦谷蛋白之间的相互作用，也有助于延长面包的货架期[32-33].因此，α-淀粉酶AmyE 在延缓面包老化方面效果显著.

3 结 论

通过考察酸面团面包在储藏过程中的质构特性、面包心的水分含量和回生焓的变化，可以证实耐酸性α-淀粉酶 AmyE 能够有效减缓酸面团面包的老化.添加AmyE 的面包样品在储藏过程中的质构变化要优于对照组和同等添加量的商业α-淀粉酶组，并且AmyE 明显减缓了面包心水分的散失和回生焓的上升速率.其中，添加AmyE 15 U/g 的抗老化效果是最好的，储藏7 d 后，可以使面包心硬度、咀嚼度及回生焓分别比对照降低27.1%、17.6 和26.3%.因此，AmyE 在酸面团面包抗老化方面具有很好的应用前景.