下调miR-421靶向Sirt3调控HepG2肝癌细胞生长和侵袭的机制研究

张寅斌， 陈银溪， 马宇光， 刘 棣， 梁 亮， 王 梦， 孙诗雨， 张淑群

西安交通大学第二附属医院内科，陕西 西安 710000

肝癌作为常见的恶性肿瘤，具有易转移、易复发等特点，肝癌细胞从原来的位置脱落，通过微循环系统进入临近或远端组织，通过恶性增殖形成新的病发灶[1]。肝癌转移与基因的表达调控有关，人们已经发现多种与肝癌发生和转移有关的调控基因，通过影响这些基因的表达可以阻碍肝癌的进展和转移[2]。miRNA是近年来研究较多的非编码RNA，其可以通过靶向调控基因的表达发挥作用，miRNA在细胞生长、分化、代谢等过程中均扮演关键角色[3]。miR-421是目前发现的与肿瘤进展有关的miRNA，其在多种肿瘤组织如胃癌、胶质瘤、骨肉瘤等组织表达上调，且可以调控肿瘤细胞的增殖和迁移过程[4-6]。有研究显示，miR-421在肝癌中高表达，可能参与肝癌进展和转移[7]。本实验探讨下调miR-421对肝癌细胞增殖和迁移的作用和靶向调控机制，为靶向基因治疗肝癌提供新思路，为研究miR-421在肿瘤进展中的调控网络提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料MXC207正常肝细胞L02购自上海美轩生物科技有限公司；ab73734 MMP-9抗体购自美国Abcam；Sirt3 siRNA、siRNA control、Inhibitor control、miR-421 inhibitor、miR-421 mimics、mimics control均由苏州吉玛基因股份有限公司构建合成；BNCC337690肝癌细胞Huh7、BNCC338070 HepG2、CRL-2234 SNU-449、BNCC338089 SMMC-7721购自美国ATCC；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；sc-53630 MMP-2抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology；突变型荧光素酶报告载体(mut)和野生型荧光素酶报告载体(wt)由中洪博元生物技术有限公司构建；Sfk11443 Sirt3抗体购自上海士锋生物科技有限公司。Sirt3 siRNA序列为：5′-AAGGTGGAAGAAGGTCCATAT-3′。

1.2 RT-PCR方法测定肝癌细胞中miR-421表达收集肝癌细胞Huh7、HepG2、SNU-449、SMMC-7721和正常肝细胞L02，在细胞中分别添加Trizol试剂，常规方法提取各细胞中的RNA。配制反转录体系，包括：0.5 μl的RT primer、0.5 μl的Primer mix、2 μl的RT buffer、2.5 μl的RNA及0.5 μl的RTase，最后添加DEPC水至10 μl，反转录条件为：16 ℃孵育30 min，42 ℃孵育90 min，72 ℃孵育5 min。取反转录得到的cDNA进行定量PCR，体系如下：0.2 μl 的Forward和Reverse primer、2.5 μl的cDNA、5 μl的RT-PCR Master Mix，添加ddH2O至10 μl。PCR反应条件为：95 ℃ 15 s；60 ℃ 15 s；72 ℃ 20 s。U6作为内参，分析miR-421表达水平。miR-421正方向引物:5′-ATCAACAGACAUUAATT-3′，反方向引物:5′-ATCAACAGACATTAATTGGG-3′。U6正方向引物:5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAA-3′，反方向引物:5′-TATGGAACGCTTCACGAATTTGC-3′。

1.3 细胞转染在肝癌细胞HepG2培养密度为40%左右时，用Lipofectamine 2000分别将Inhibitor control、miR-421 inhibitor转染到细胞中(步骤参照试剂盒说明书)，并命名为Inhibitor control组、miR-421 inhibitor组。把未转染的肝癌细胞HepG2命名为Control组。收集培养24 h后的Control、Inhibitor control、miR-421 inhibitor细胞，按照1.2中RT-PCR方法检测下调效果。

1.4 MTT测定miR-421 inhibitor对肝癌细胞增殖影响Control、Inhibitor control、miR-421 inhibitor细胞按每孔中加入1×104个细胞接种至96孔板，添加100 μl 的细胞培养液，培养24 h后，在每孔中添加20 μl 的MTT，然后放在细胞培养箱中孵育4 h。把孔内的上清吸弃后，添加150 μl的DMSO溶液，在酶标仪上检测每个孔的A值。

1.5 Transwell小室测定miR-421 inhibitor对肝癌细胞迁移和侵袭影响细胞侵袭实验前用Matrigel包被小室，其余同迁移实验，包被步骤为：以50 mg/L的Matrigel按照1∶8稀释，包被Transwell小室的上室，然后放在4 ℃条件下风干，Matrigel凝聚成胶后进行侵袭实验。收集Control、Inhibitor control、miR-421 inhibitor细胞，悬浮在不含血清的细胞培养液中，细胞密度1×105ml-1，吸取200 μl添加到小室的上室内，然后在24孔板的下室中加500 μl的含胎牛血清的细胞培养液，在培养箱中培养24 h后，取棉签将未穿膜的细胞擦掉，置于甲醇中固定，添加质量浓度为1 g/L的结晶紫溶液染色，PBS洗涤。在显微镜下选择5个视野分析细胞迁移和侵袭数目。

1.6 Western blotting检测miR-421 inhibitor对肝癌细胞中MMP-9和MMP-2蛋白表达影响Control、Inhibitor control、miR-421 inhibitor细胞培养24 h后，添加含有PMSF浓度为1 mmol/L的RIPA裂解液，放在冰上裂解30 min，用细胞刮刀将细胞收集，以12 000×g离心10 min，然后将上清转移到离心管中，用BCA蛋白定量试剂盒对蛋白浓度进行检测。配制SDS-PAGE凝胶，按照每孔中添加30 μg蛋白样品进行上样，蛋白样品上样前同等体积的Loading buffer混合煮沸变性，设置恒压100 V电泳，观察溴酚蓝染料进入到凝胶的末端后，停止电泳。在4 ℃条件下将蛋白转移到NC膜上，转膜电流为125 mA。将NC膜放在质量浓度为50 g/L脱脂奶粉中，于室温条件孵育2 h。然后将NC膜依次放在一抗、二抗反应液中，在室温中结合2 h。一抗按照1∶1 000稀释，二抗按照1∶2 000稀释。ECL显色。把GAPDH作为内参，分析MMP-9和MMP-2蛋白水平。

1.7 miR-421靶基因预测和鉴定利用生物信息学软件Targetscan分析，发现Sirt3可能是miR-421的靶基因，利用荧光素酶报告系统鉴定靶向关系。将突变型荧光素酶报告载体(mut)和野生型荧光素酶报告载体(wt)分别与miR-421 mimics、mimics control共转染到肝癌细胞中，荧光素酶报告载体为pmirGLO。24 h后，使用荧光素酶活性测定试剂盒检测荧光素酶活性。

1.8 Sirt3 siRNA对下调miR-421影响肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用将miR-421 inhibitor、siRNA control和miR-421 inhibitor、Sirt3 siRNA分别共转染到肝癌细胞HepG2中，并命名为miR-421 inhibitor+si-NC、miR-421 inhibitor+si-Sirt3。利用MTT、Transwell小室及Western blotting方法检测细胞增殖、侵袭迁移和MMP-9、MMP-2、Sirt3表达，RT-PCR方法检测细胞中Sirt3 mRNA水平，Sirt3内参为GAPDH，步骤同上。

2 结果

2.1 miR-421在肝癌细胞中表达上调肝癌细胞Huh7、HepG2、SNU-449、SMMC-7721中miR-421表达水平均明显高于正常肝细胞L02 (P<0.05)。肝癌细胞HepG2中miR-421表达水平高于肝癌细胞Huh7、SNU-449、SMMC-7721 (P<0.05)。miR-421在肝癌细胞中表达上调，选用肝癌细胞HepG2做后续实验(见表1)。

2.2 miR-421 inhibitor降低肝癌细胞增殖、侵袭和迁移能力与转染Inhibitor control的肝癌细胞比较，转染miR-421 inhibitor后的肝癌细胞中miR-421水平降低，细胞增殖活性降低，细胞侵袭和迁移数目减少，细胞中MMP-9、MMP-2蛋白表达水平下降(P<0.05)。miR-421 inhibitor降低肝癌细胞增殖、侵袭和迁移能力(见图1～2、表2)。

表1 miR-421在肝癌细胞和正常肝细胞中的表达变化Tab 1 Changes of expression of miR-421 in liver cancer cells and normal liver cells

注：与L02相比，*P<0.05；与HepG2相比，#P<0.05。

图1 Western blotting检测miR-421 inhibitor转染后肝癌

图2 miR-421 inhibitor转染后肝癌细胞中miR-421迁移数目和侵袭数目(200×) Fig 2 Number of miR-421 migration and invasions in liver cancer cells after miR-421 inhibitor transfection (200×)

组别miR-421水平A值迁移数目侵袭数目MMP-9蛋白MMP-2蛋白Control1.00±0.100.57±0.08265.14±36.21205.48±13.240.68±0.070.87±0.08Inhibitor control1.01±0.070.56±0.04268.07±18.54210.73±16.380.69±0.050.86±0.07miR-421 inhibi-tor0.27±0.03∗0.34±0.04∗185.34±14.16∗142.91±12.80∗0.27±0.03∗0.51±0.05∗F值102.58915.84410.68821.09462.27727.413P值0.0000.0040.0110.0020.0000.000

注：与Inhibitor control相比，*P<0.05。

2.3 miR-421靶向调控Sirt3Sirt3可能为miR-421的靶基因，且miR-421 mimics和wt共转染后的肝癌细胞荧光素酶活性降低。miR-421靶向调控Sirt3(见图3、表3)。

图3 miR-421靶基因预测结果 Fig 3 Predictive results of miR-421 target gene

组别mutwtmimics control1.00±0.111.00±0.09miR-421 mimics0.98±0.070.36±0.05t值0.26610.767P值0.8040.000

2.4 下调miR-421提高肝癌细胞中Sirt3蛋白表达水平与转染Inhibitor control的肝癌细胞比较，转染miR-421 inhibitor后的肝癌细胞中Sirt3蛋白水平升高(P<0.05)。miR-421 inhibitor提高肝癌细胞中Sirt3蛋白表达水平(见图4、表4)。

图4 Western blotting检测miR-421 inhibitor转染后

组别Sirt3蛋白Control0.47±0.06Inhibitor control0.48±0.04miR-421 inhibitor1.02±0.09∗F值67.015P值0.000

注：与Inhibitor control相比，*P<0.05。

2.5 Sirt3 siRNA逆转下调miR-421对肝癌细胞增殖、侵袭和迁移影响与共转染miR-421 inhibitor和siRNA control的肝癌细胞比较，共转染miR-421 inhibitor和Sirt3 siRNA后的肝癌细胞中Sirt3水平降低，细胞增殖活性升高，迁移和侵袭数目增多，MMP-2、MMP-9蛋白表达水平升高(P<0.05)。Sirt3 siRNA逆转下调miR-421对肝癌细胞增殖、侵袭和迁移影响(见图5～6、表5)。

图5 Western blotting检测miR-421 inhibitor和Sirt3 siRNA

图6 miR-421 inhibitor和Sirt3 siRNA共转染后肝癌细胞迁移数目和侵袭数目(200×) Fig 6 Number of metastasis and invasion in liver cancer cells after co-transfection of miR-421 inhibitor and Sirt3 siRNA(200×)

3 讨论

miRNA是长度为20～22 bp的小分子RNA，能够通过碱基配对的方式抑制mRNA的翻译。 miRNA在人类组织中广泛表达并参与生理进程，在细胞分化、脂质代谢、免疫反应等过程中发挥重要作用[8]。研究显示，miRNA与人类疾病如缺血损伤、高血压、心脏病的发生有关[9-11]。miRNA在肿瘤发生中的作用引起医学工作者的广泛关注，肿瘤组织中miRNA表达改变与肿瘤患者的临床病理特征有关，通过干扰或上调miRNA的表达可以抑制肿瘤进程[12]。miR-421在胃癌中表达上调，下调miR-421能够抑制胃癌细胞的生长，后续在乳腺癌、骨肉瘤等肿瘤中也发现miR-421的促肿瘤生长作用[4,6,13]。本实验显示，miR-421在肝癌细胞中的表达水平高于正常肝细胞，且下调miR-421可以抑制肝癌细胞的增殖，提示miR-421在肝癌恶性进展中可能发挥促进作用。

表5 miR-421 inhibitor和Sirt3 siRNA共转染后肝癌细胞A值、迁移数目、侵袭数目和Sirt3、MMP-2、MMP-9表达水平Tab 5 A value, number of migration, number of invasions and expressions of Sirt3, MMP-2, MMP-9 after co-transfection of miR-421 inhibitor and Sirt3 siRNA

肿瘤转移是诱发肿瘤患者死亡的重要原因，肿瘤转移是一个复杂过程。肿瘤细胞在转移过程中可以合成能够降解细胞外基质的蛋白酶，从而为肿瘤细胞的侵袭和迁移提供条件[14]。研究显示，基质金属蛋白酶家族是细胞外基质降解的关键蛋白酶，也是肿瘤转移过程中的标志[15]。MMP-2和MMP-9是基质金属蛋白酶家族的成员，在肿瘤转移过程中发挥促进作用，其表达水平升高是细胞转移能力增加的标志[16-17]。本实验显示，下调miR-421后的肝癌细胞侵袭和迁移能力均下降，且细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达水平也降低，提示下调miR-421抑制肝癌细胞侵袭和迁移，靶向抑制miR-421可能是抑制肝癌转移的有效途径。

miRNA发挥生物学作用与影响靶蛋白的表达有关，且miRNA在不同的组织和病理过程中的靶基因可能不同[18]。本实验显示，Sirt3受到miR-421的靶向负调控作用，miR-421作用机制可能与Sirt3有关。Sirt3属于第Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶，其在受到相关信号刺激后可以激活核糖转移酶活性和去乙酰化酶活性，影响目的蛋白的表达[19]。研究显示，Sirt3与肿瘤进展有关，Sirt3基因敲除的小鼠患肿瘤的风险明显增加[20]。Sirt3敲除后的小鼠胚胎成纤维细胞能够从单一的致癌基因感染而诱发肿瘤的发生[21]。Sirt3在肿瘤组织中的表达水平低于正常组织，Sirt3能够抑制肿瘤细胞体外生长、转移[22]。本实验表明，下调Sirt3可以逆转下调miR-421对肝癌细胞增殖和迁移的抑制作用，提示下调miR-421通过靶向影响Sirt3表达抑制肝癌进程。

总之，miR-421可能是肝癌进展和转移中的促进因子，靶向抑制miR-421可能是治疗肝癌的途径。下调miR-421可以通过靶向调控Sirt3的表达影响肝癌细胞的生长和侵袭、迁移，这为研究miR-421在肝癌中的作用和调控机制提供了参考。