珍珠梅中γ-羟基腈苷Sutherlandin-5-cis-p-coumarate的抗炎、镇痛活性研究△

鲁文雪，赵莹，孙亚楠，曲桂武*，吴长景

1.滨州医学院 抗衰老研究所，山东 烟台 264003；2.周口师范学院，河南 周口 466001

羟基氰苷是一类苷元中含有氰基的氧苷类化合物，根据氰基相对于氧苷键的位置，又将这类化合物分为α-羟基腈苷和γ-羟基腈苷两类。其中α-羟基腈苷易被β-葡萄糖苷酶或稀酸催化水解，生成的α-羟基腈苷元很不稳定，会继续分解为醛(酮)和氢氰酸，而γ-羟基腈苷则不会发生这类反应[1]。

Sutherlandin-5-cis-p-coumarate是从蔷薇科珍珠梅属植物珍珠梅Sorbariasorbifolia(L.)A.Braun中分离得到的一个γ-羟基腈苷化合物，其化学结构如图1所示。我们曾报道过该化合物能显著抑制LPS刺激的RAW 264.7细胞炎症因子NO的释放水平[2]。由于该化合物分子中的氰基属γ-羟基腈结构，难以被酶或酸催化水解[3]，因此具有良好的化学稳定性。Sutherlandin-5-cis-p-coumarate的抗炎药理活性与化学稳定性特点，使其具有潜在的药用研究价值。

图1 Sutherlandin-5-cis-p-coumarate化学结构

关于Sutherlandin-5-cis-p-coumarate抗炎活性的进一步研究有待进行。本实验通过对二甲苯致小鼠耳廓肿胀实验、醋酸致小鼠腹腔毛细管通透性增加实验、醋酸致小鼠扭体实验和小鼠热板实验[4-8]，确认Sutherlandin-5-cis-p-coumarate腹腔注射时的抗炎、镇痛活性，为其进一步的成药性研究提供参考。

1 材料

1.1 动物

SPF级昆明小鼠，雌雄各半，体质量(20±2)g，由济南鹏悦实验动物繁育有限公司提供，动物合格证号：SCXK(鲁)20140007。

1.2 药品与试剂

Sutherlandin-5-cis-p-coumarate对照品(实验室自制，无色针状结晶，1H-NMR与13C-NMR光谱数据与文献[2]相符)；珍珠梅采自青岛市黄岛区太行山小区院内，经滨州医学院抗衰老研究所曲桂武副教授鉴定为蔷薇科植物珍珠梅Sorbariasorbifolia(L.)A.Braun的地上部位；层析硅胶(100～200目，黄海化学试剂公司)；醋酸泼尼松片(浙江仙琚制药股份有限公司，批号：160337)；阿司匹林(石药集团，批号：018171287)；伊文思蓝(中国医药集团化学试剂有限公司，批号：871225)；水为Milli-Q超纯水。羧甲基纤维素钠(规格：20 g·L-1水溶液，黏度为500～800 mPa·s)与其他试剂均为分析纯，中国医药集团化学试剂有限公司生产。

1.3 仪器

2545B型制备色谱仪(美国Waters)；YMC-Actus C18制备型反相色谱柱(50 mm×20 mm，5 μm，日本YMC)；Thermo Fisher UltiMate3000高效液相色谱仪(美国Thermo公司)；Phenomenex C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，Phenomenex)；电子天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；UV-2600型紫外分光光度计(日本岛津株式会社)；YLS-6B型智能热板仪(济南益延科技发展有限公司)；KQ-50B超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Hei-VAP Precision旋转蒸发仪(德国Heidolph)。

2 方法

2.1 供试品制备

取珍珠梅药材，粉碎后用乙醇回流提取。收集提取液，按参考文献[2]所述方法依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，取乙酸乙酯萃取部位，经硅胶柱层析、Sephadex LH-20柱层析、反相制备色谱处理，即得无色针状Sutherlandin-5-cis-p-coumarate结晶。

2.2 样品溶液制备

分别精密称取Sutherlandin-5-cis-p-coumarate及研磨成粉末的醋酸泼尼松和阿司匹林适量，加入5%的羧甲基纤维素钠溶液，超声混匀，制成质量浓度分别为0.5、1.0、2.0 mg·mL-1的Sutherlandin-5-cis-p-coumarate混悬液，质量浓度为0.15 mg·mL-1的醋酸泼尼松混悬液，质量浓度为0.75 mg·mL-1的阿司匹林混悬液。

2.3 对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响

取健康SPF级昆明小鼠50只，雌雄各半，按体质量随机分成5组，分别为空白对照组(5%羧甲基纤维素钠溶液灌胃组)，醋酸泼尼松组，Sutherlandin-5-cis-p-coumarate的高、中、低剂量组。每组每天灌胃给药1次，每次0.4 mL，连续7 d，于末次给药1 h后，在各组小鼠右耳正反面涂抹0.1 mL二甲苯致炎，左耳不做处理。30 min后脱颈椎处死小鼠，沿耳廓基线剪下左右两只耳片，用8 mm直径打孔器分别在同一部位打下圆耳片，立即精密称质量，并按公式(1)和(2)计算每只小鼠的耳廓肿胀度和肿胀抑制率[9-10]。

肿胀度=右耳片质量-左耳片质量

(1)

肿胀抑制率=(空白对照组平均肿胀度-给药组平均肿胀度)/空白对照组平均肿胀度×100%

(2)

2.4 对醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性的影响

取健康SPF级昆明小鼠50只，雌雄各半，按2.3项下方法分组与给药，并在末次给药1 h后，给予各组每只小鼠尾静脉注射0.5%的伊文思蓝0.9%氯化钠溶液0.2 mL，随即腹腔注射0.7%的冰醋酸溶液0.2 mL，30 min后脱颈处死小鼠，腹腔注射5 mL 0.9%氯化钠溶液，轻揉小鼠腹部，打开腹腔，收集腹腔洗液，3000 r·min-1离心10 min，取上清液，于590 nm波长下测其吸光度值(A)，按公式(3)计算渗出抑制率[11]。

(3)

2.5 对醋酸致小鼠扭体反应的影响

取健康SPF级昆明小鼠50只，雌雄各半，按2.3项下方法分组与给药(以阿司匹林为阳性对照)，并在末次给药1 h后，每只腹腔注射0.6%的醋酸溶液0.2 mL，记录每只小鼠在20 min内的扭体次数，按公式(4)计算镇痛率[12-13]。

镇痛率=(空白对照组扭体次数-给药组扭体次数)/空白对照组扭体次数×100%

(4)

2.6 对热板刺激引起小鼠疼痛反应的影响

将智能热板仪温度调节至(55.0±0.5)℃，将小鼠置于其中，同时启动电子计时器，以小鼠开始舔后足或出现跳跃现象所需的时间为痛阈值，共测2次，每次间隔30 min，取两次结果的平均值作为该小鼠给药前的正常痛阀值[14]。选取正常痛阀值在5～30 s的小鼠50只，雌雄各半，按2.3项下方法分组与给药(以阿司匹林为阳性对照)，并于末次给药后30、60、90 min，分别以热板法测量各组小鼠的痛阈值，如60 s后仍无反应，将小鼠取出，以免烫伤，其痛阈值以60 s计。

2.7 统计学处理

3 结果

3.1 对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响

实验结果如表1所示。Sutherlandin-5-cis-p-coumarate对二甲苯致小鼠耳廓肿胀具有抑制作用，高、中、低3个剂量的肿胀抑制率分别为72.42%、57.43%、27.70%，且高、中剂量组与空白对照组相比，差异具有统计学意义(P<0.01)，肿胀抑制率高于或接近阳性对照组，提示Sutherlandin-5-cis-p-coumarate具有抗炎消肿作用。

表1 Sutherlandin-5-cis-p-coumarate对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响

注：与空白对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；下同。

3.2 对醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性的影响

实验结果如表2所示。与空白对照组比较，Sutherlandin-5-cis-p-coumarate高、中、低3个剂量组的渗出抑制率分别为60.87%、69.57%、19.56%，且高、中剂量组与空白对照组相比，差异具有统计学意义(P<0.01)，提示高、中剂量的Sutherlandin-5-cis-p-coumarate具有抗炎作用。

表2 Sutherlandin-5-cis-p-coumarate对醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性的影响

3.3 对醋酸致小鼠扭体反应的影响

实验结果如表3所示。与空白对照组比较，Sutherlandin-5-cis-p-coumarate高、中、低3个剂量组的抑制率分别为63.05%、57.54%、35.81%，且高、中剂量组与空白对照组相比，差异具有统计学意义(P<0.01)，抑制率与阳性对照相近，提示Sutherlandin-5-cis-p-coumarate对醋酸刺激引起的小鼠致疼反应有抑制作用。

表3 Sutherlandin-5-cis-p-coumarate对醋酸致小鼠扭体反应的影响

3.4 对热板刺激引起小鼠疼痛反应的影响

实验结果如表4所示。与空白对照组比较，Sutherlandin-5-cis-p-coumarate高、中、低3个剂量组在给药30 min后的痛阀值明显延长，差异具有统计学意义(P<0.01)，提示Sutherlandin-5-cis-p-coumarate对小鼠因热板刺激引起的疼痛具有抑制作用。

4 讨论

珍珠梅Sorbariasorbifolia(L.)A.Braun广泛分布于云南、贵州、四川、甘肃、宁夏及东北，有活血祛瘀、消肿止痛的作用，主治跌打损伤、骨折、风湿痹痛；苦、寒，有毒，归肝、肾经[13]。现有文献主要报道了珍珠梅乙酸乙酯提取物的多种药理活性[15-19]，但具体物质基础仍有待阐明。我们曾报道在珍珠梅中发现的氰苷化合物，能够抑制LPS刺激的RAW 264.7细胞炎症因子NO的释放水平。其中的α-羟基腈苷可在酶或稀酸作用下水解产生氢氰酸，由此可以解释珍珠梅具有的毒性；而以Sutherlandin-5-cis-p-coumarate为代表的γ-羟基腈苷，由于具有良好的化学稳定性与药理活性，则有望在珍珠梅的临床应用中扮演重要的角色。

本研究采用动物模型考察了Sutherlandin-5-cis-p-coumarate的抗炎镇痛活性，并分别以醋酸泼尼松和阿司匹林为抗炎和镇痛模型的阳性对照药，所用剂量系根据人用剂量换算而来。所采用的4种模型，则是药物抗炎、镇痛活性研究的常用模型，其中二甲苯致小鼠耳廓肿胀模型和醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增加模型，均可产生局部血管扩张及毛细血管通透性增加等炎症的典型特征；腹腔注射醋酸可增加腹腔液中的前列腺素等致痛物质，从而使外周痛觉神经敏化，使小鼠产生扭体反应，而热板法比化学刺激致小鼠扭体反应更敏感，更能反映药物的镇痛活性。Sutherlandin-5-cis-p-coumarate经灌胃给药后，对二甲苯致小鼠耳廓肿胀和醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性的增加，以及对因醋酸刺激和因热板刺激引起的小鼠疼痛反应均具有不同程度的抑制作用，且呈现出一定的量效关系，预示Sutherlandin-5-cis-p-coumarate在抗炎镇痛药物研究领域具有潜在的价值，但具体的作用机制还有待于进一步研究。

表4 Sutherlandin-5-cis-p-coumarate对热板刺激引起小鼠疼痛反应的影响