壮药山风中的黄酮类化学成分研究△

何丽丽，姚彩云，闫炳雄，吴玲玲，刘喜慧，缪剑华，宋志军

西南濒危药材资源开发国家工程实验室/广西壮族自治区药用植物园，广西 南宁 530023

山风为菊科艾纳香属多年生草本植物，学名馥芳香艾纳Blumeaaromatica(Wall.)DC，又名香艾，为广西民间应用非常广泛的草药，《广西中药材标准》《现代本草纲目》《壮药质量标准》等记载，山风味辛、微苦，性温，气香，主治风湿性关节炎、湿疹、皮肤瘙痒；壮医，调龙路火路，祛毒湿，止痒，用于发旺(风湿骨痛)，能晗能累(湿疹)。山风是广西盈康药业“华佗风痛宝”系列产品的主要原料药之一。山风作为壮药，在广西民间有悠久的药用历史，但一直缺乏质量标准，直到2008年才收录入《壮药质量标准》第一卷，且只有性状鉴定，缺乏定量的质量控制指标，甚至没有最基本的薄层鉴别。此前，人们对艾纳香属植物的研究比较多的是艾纳香、东风草、假东风草[1-2]。关于山风化学成分的研究仅有几篇文献报道[3-5]，其中黄酮类化合物共有12个，还不足以说明山风黄酮类化合物的活性物质基础。为了进一步揭示山风药理活性的化学物质基础，充分挖掘民族药的潜力，开发其活性成分，提升质量标准，本实验对山风的化学成分进行了系统的研究，从山风乙酸乙酯部位中共分到了7个黄酮类化合物，通过理化常数的测定、各种光谱数据的分析，确定了它们的结构。

1 材料与仪器

1.1 材料

由广西盈康药业提供的山风全草(华佗风痛宝的原料药)，经盈康药业执业药师梁峰鉴定为馥芳香艾纳Blumeaaromatica(Wall.)DC，其标本(No.153603)保存在广西壮族自治区药用植物园标本馆。

1.2 仪器及试剂

Sephadex LH-20凝胶(Pharmacia公司)；ODS-C18反相填料(50 μm)(Silicycle，Canada)；薄层色谱(GF254)和柱色谱硅胶(160～200、200～300目，青岛海洋化工厂)。实验中所用到的石油醚、甲醇、丙酮、三氯甲烷等溶剂均为色谱级，购自天津富宇化工有限公司。

600兆核磁共振仪(Varian-600 MHz NMR Spectrometer，瓦里安)，液-质联用仪(Varian 320-MS，瓦里安)，分析型高效液相色谱仪(Varian 210，瓦里安)，制备型液相色谱仪(Preparative HPLC 218，瓦里安)，XR4显微熔点测定仪(上海光学仪器厂)。

2 提取与分离

粉碎后的干燥药材2 kg通过80%乙醇水提取浓缩，得到提取物(143 g)，将该提取物分散在40 ℃的热水(含乙醇20%)中，经石油醚萃取除脂后，以乙酸乙酯萃取得到77 g提取物。乙酸乙酯萃取部分经MCI脱叶绿素后经硅胶柱色谱，以三氯甲烷-甲醇(50∶1～1∶1)梯度洗脱，TLC检测合并相似部位后得到5个部分。A部分主要为低极性脂肪酸等，弃去。B部分经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，甲醇洗脱，再结合重结晶或硅胶Flash柱色谱分离纯化，得到化合物2(12.1 mg)、4(35.0 mg)、9(5.3 mg)及10(18.2 mg)；D部分经反相制备色谱，以甲醇-水(5%～95%)梯度洗脱，结合SephadexLH-20凝胶柱色谱纯化得到化合物1(5.3 mg)和3(18.7 mg)；E部分经Sephadex LH-20凝胶柱色谱得到黄色的黄酮类化合物5(4.8 mg)、6(5.7 mg)、7(17.8 mg)。C部分经TLC检测，主要成分是前后B、D的交叉，未做进一步分离。

3 结果

化合物1：金黄色细针状晶，ESI-MSm/z：343 [M-H]-，345 [M+H]+提示其分子式为C18H16O7。1H-NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ：6.56(1H，s，H-8)及12.43(1H，s，5-OH)提示A环仅有一个氢原子未被取代，δ7.03(2H，d，J=8.4 Hz，H-3′，H-5′)和8.02(2H，d，J=8.4 Hz，H-2′，H-6′)，示有一个对称的B环；δ4.03(3H，s)，3.86(3H，s)，3.91(3H，s)的3个孤立特征单峰提示有3个甲氧基存在。其碳谱13C-NMR(DMSO-d6，150 MHz)δ：155.0(C-2)，138.4(C-3)，179.2(C-4)，152.3(C-5)，130.0(C-6)，156.1(C-7)，93.1(C-8)，151.8(C-9)，106.2(C-10)，122.8(C-1′)，130.2(C-2′，C-6′)，114.1(C-3′，C-5′)，161.7(C-4′)，60.1，59.8，55.3(3个-OCH3)与文献[6]报道的Santin一致。

化合物2：为亮黄色固体，质谱提示其分子量为284，ESI-MSm/z：283[M-H]-，285[M+H]+，扣除母核的222，尚余62个质量单位，提示该化合物可能是有2个羟基取代，1个甲氧基取代的黄酮，碳谱中δ128.1及114.6峰高为其他峰的2倍，提示B环为4′位的单取代模式，δ99.3及94.2的高场芳碳信号提示A环是5，7-二取代模式，查阅文献，发现它的13C-NMR(DMSO-d6)数据(δc)：163.8(C-2)，103.9(C-3)，182.3(C-4)，161.7(C-5)，99.3(C-6)，164.2(C-7)，94.2(C-8)，157.5(C-9)，104.6(C-10)，123.7(C-1′)，128.1(C-2′)，114.6(C-3′)，162.5(C-4′)，114.8(C-5′)，128.1(C-6′)，56.3(-OCH3)与金合欢素(acacetin)一致[7]，故鉴定该化合物为金合欢素(又名刺槐素或刺槐黄素)。

化合物3：黄色针状晶体，ESI-MS给出准分子离子峰m/z269 [M-H]-，提示其分子量为270，其氢谱δ7.92(2H，d，J=9.0，H-2′，6′)，6.92(2H，d，J=9.0，H-3′，5′)的信号提示示它的B环具有AA′BB′模式的耦合系统，低场的δ12.96(1H，s，5-OH)羟基信号表明它有5-OH，在δ6.77的单峰为H-3信号，δ6.48(1H，d，J=1.8，H-8)，6.19(1H，d，J=1.8，H-6)显示该化合物的A环有两个未取代的间位氢，没有甲氧基信号。查阅文献，发现它的氢谱数据与文献[8]报道的芹菜素一致，故确定该化合物为4′，5，7-三羟基黄酮，即芹菜素(apigenin)。

化合物4：黄色粉末，ESI-MS显示准分子离子峰m/z：361 [M+H]+和359 [M-H]-，说明该化合物分子量为360，1H-NMR和13C-NMR谱显示有3个甲氧基，13C-NMR谱在低场区的15个碳信号说明此化合物为一个黄酮类化合物。1H-NMR谱提示其B环的3′和4′位上质子被取代[δ6.95(1H，d，J=8.4 Hz，H-5′)，7.63(1H，d，J=1.8 Hz，H-2′)和7.55(1H，dd，J=8.4，1.8 Hz，H-6′)]，而A环只剩下H-8没有被取代[δ6.56(1H，s)]，在δ12.74处的1个单峰信号，提示有1个5-OH。根据分子量，应该还有两个羟基，查阅文献[6]，发现该化合物的NMR数据：1H-NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ：12.74(s，C5-OH)，7.63(d，J=1.8 Hz，H-2′)，7.55(dd，J=8.4，1.8 Hz，H-6′)，6.95(d，J=8.4 Hz，H-5′)，6.56(s，H-8)和13C-NMR(DMSO-d6，150 MHz)δ：156.1(C-2)，137.8(C-3)，178.4(C-4)，152.7(C-5)，131.3(C-6)，157.5(C-7)，94.6(C-8)，152.1(C-9)，105.2(C-10)，122.8(C-1′)，116.2(C-2′)，147.8(C-3′)，150.5(C-4′)，112.5(C-5′)，121.3(C-6′)，56.2，60.1，60.2(-OCH3)与化合物3，6，4′-三甲氧基-5，7，3′-三羟基黄酮，即矢车菊黄素(centaureidin)一致。

化合物5：黄色粉末，ESI-MS在m/z：301 [M+H]+和299 [M-H]-的准分子离子峰说明其分子量为300。扣除黄酮母核222的质量数，尚余78，恰好符合黄酮类母核增加3个羟基及1个甲氧基所需的质量数。由1H-NMR和13C-NMR特征可知该化合物也是1个黄酮类化合物，氢谱耦合常数提示该化合物的B环为1个ABX耦合系统，而A环5位上也有1个羟基[δ12.90(1H，s)]，δ6.22和6.52(d，J=1.8 Hz，each 1H)的1组耦合质子表明了H-7也被取代。此外氢谱显示还有1个甲氧基和另外2个羟基，与文献[9]对照，其1H-NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ：12.90(C5-OH)，10.53(C7-OH)，9.98(C4′-OH)，7.56(2H，m，H-2′，H-6′)，6.96(1H，d，J=8.4，H-5′)，6.22和6.52(d，J=1.8 Hz，each 1H，H-6及H-8)和13C-NMR(DMSO-d6，150 MHz)δ：164.2(C-2)，103.4(C-3)，182.1(C-4)，157.6(C-5)，99.4(C-6)，164.1(C-7)，94.9(C-8)，161.8(C-9)，104.5(C-10)，122.5(C-1′)，110.2(C-2′)，151.1(C-3′)，148.6(C-4′)，116.1(C-5′)，120.5(C-6′)，56.2(-OCH3)与3′-甲氧基-5，7，4′-三羟基黄酮一致，故该化合物鉴定为3′-甲氧基-5，7，4′-三羟基黄酮，即金圣草黄素或柯伊利素(chrysoeriol)。

化合物6：黄色粉末，在254 nm的紫外灯照射下有深色荧光，TLC展开后喷硫酸-香草醛加热显黄色斑点。ESI-MS给出准分子离子峰m/z：285 [M-H]-和571 [2M-H]-，推测其分子量为286。1H-NMR谱在δ9～13显示出4个活泼羟基质子信号。分别为12.85(1H，s)、10.58(1H，brs)、9.81(1H，brs)和9.51(1H，brs)。13C-NMR谱在δ94～183显示有黄酮骨架的15个碳信号峰，故推测该化合物应该为1个黄酮类化合物，与文献对照，其1H-NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ：6.18(1H，d，J=1.8 Hz，H-6)，6.38(1H，d，J=1.8 Hz，H-8)，6.61(1H，s，H-3)，6.77(1H，d，J=8.4 Hz，H-5′)，7.35(1H，d，J=1.8 Hz，H-2′)，7.42(1H，dd，J=8.4，1.8 Hz，H-6′)及12.85(1H，s)、10.58(1H，brs)、9.81(1H，brs)和9.51(1H，brs)4个羟基信号和13C-NMR(DMSO-d6，150 MHz)δ：164.3(C-2)，103.4(C-3)，182.1(C-4)，161.7(C-5)，99.3(C-6)，164.5(C-7)，94.3(C-8)，157.9(C-9)，104.0(C-10)，122.4(C-1′)，113.9(C-2′)，146.4(C-3′)，150.6(C-4′)，116.5(C-5′)，119.7(C-6′)与木犀草素的基本一致[10]，故鉴定该化合物为木犀草素(luteolin)。

化合物7：黄色无定型粉末。ESI-MSm/z：433[M-H]-，提示其分子量为434。1H-NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ：6.72(1H，s，H-3)，6.43(1H，d，J=1.8 Hz，H-6)，6.78(1H，d，J=1.8 Hz，H-8)，7.38(1H，d，J=1.8 Hz，H-2′)，6.91(1H，d，J=8.4 Hz，H-5′)，7.43(1H，dd，J=1.8，8.4 Hz，H-6′)，5.03(1H，d，J=7.2 Hz，H-1″)，3.20～3.50(6H，m，H-2″～H-5″)。以上数据及13C-NMR(DMSO-d6)数据(δC)：164.3(C-2)，103.4(C-3)，182.2(C-4)，156.9(C-5)，99.5(C-6)，163.2(C-7)，94.2(C-8)，160.6(C-9)，105.9(C-10)，121.8(C-1′)，114.9(C-2′)，144.9(C-3′)，150.6(C-4′)，115.5(C-5′)，119.3(C-6′)，99.79(C-1″)，73.3(C-2″)，76.4(C-3″)，69.6(C-4″)，77.5(C-5″)，61.2(C-6″)与文献[11]报道的木犀草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷一致，与木犀草苷对照品在正反向薄层板上具有相同的Rf值斑点，故鉴定该化合物为木犀草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

图1 化合物1～7的化学结构

4 结论

黄酮类化合物在药用植物中普遍存在，是活性非常广泛的天然产物，具有抗氧化、抗癌、延缓衰老、消炎杀菌等功效。本研究从壮药山风中提取分离得到7个黄酮化合物，除了木犀草素[3-4](文献纠正：蓝鸣生等于2012年报道的山风中的7，3，-二甲基芦丁有误，从核磁共振数据及英文名“luteolin-7，3-dimethyl ether”可以看出该化合物当为7，3，-二甲氧基木犀草素[5])，其余化合物均为首次从该植物中发现。根据文献报道，这些化合物具有很好的药理活性。如化合物1具有抗炎、抗病毒[12-13]及黄嘌呤氧化酶的抑制活性[14]，这也许可以诠释该药治疗痛风及风湿病的机理；金合欢素(2)、芹菜素(3)具有抗癌及抗氧化活性[15-18]；矢车菊黄素(4)具有很强的免疫增强调节作用，可抑制黑色素从生黑素细胞向角质形成细胞转移，具有舒张血管的活性[19-20]；金圣草黄素(5)除了具有抗炎、抗感染活性，也可能是胰腺癌等肿瘤治疗的先导化合物[21-23]，是一种选择性的PI3K-AKT-mTOR通路抑制剂[23-24]；木犀草素(6)除了具有抗炎、抗感染活性，还可以抑制环腺苷-磷酸二酯酶活性，可能是山风治疗痛风及风湿病的活性物质基础之一[22，25]；木犀草苷(7)具有抗感染、治疗骨质增生的活性[26-27]。这些化学成分的分离鉴定为山风的药效物质基础研究奠定了基础，对山风的药效机理研究有重要的意义。